Inleiding
De meeste hemocytometrieapparatuur die in de klinisch chemische laboratoria in Nederland wordt gebruikt, heeft beperkingen wat betreft het maximale formaat buis dat kan worden aangeboden. Zo ook de Sysmex XN celtellers zoals die momenteel in het Academisch Medisch Centrum (AMC) te Amsterdam worden gebruikt. Evenals zijn voorgangers in ons laboratorium, de XE-5000 van Sysmex en de CellDyn 4000 van Abbott, kunnen ook de XN10 en XN20 alleen overweg met 3 of 4 ml EDTA-vacuümbuizen met een formaat van 13 x 75 mm. Dit geldt zowel voor het aanbieden van monsters in rekken via de transportband als voor individuele monsters in de single mode. Ook aan de andere onderdelen van de hematologiestraat, te weten de SP10 slide-maker-stainer, de DI-60 automatische microscoop, de TS-10 buizensorteerder en de bezinkingsautomaat, kunnen alleen klein formaat EDTA buizen worden aangeboden. Helaas is het onvermijdelijk dat er ten behoeve van een aantal specifieke bepalingen in ons ziekenhuis ook EDTA-buizen van een groter formaat in omloop zijn (16 x 100 mm). Dit heeft tot gevolg dat er met enige regelmaat door de kliniek groot formaat EDTA-buizen worden aangeboden voor de hemocytometriebepalingen, die niet op de apparatuur passen. Derhalve wordt bij het aanleveren van perifeer bloed in het verkeerde formaat EDTA-buis het materiaal al sinds jaar en dag overgeschonken in een 4 ml glazen stolbuis zonder toevoegingen (rode dop). Het overschenken in een buis met septumdop heeft als voordeel dat de buis in een rek aan de hematologiestraat kan worden geboden. Dit beperkt het aantal manuele handelingen. Daarnaast voorkomt dit vertraging van de doorlooptijden doordat een van de tellers in single mode moet worden gezet. De stolbuizen worden ook toegepast voor het aanleveren van allerhande niet-volbloedmaterialen voor celtellingen. Zo worden door het Laboratorium Genetische Metabole Ziekten van het AMC regelmatig batches van erytrocytensuspensies aangeboden. Ook dan is het prettig wanneer deze in rekken aan de apparatuur kunnen worden aangeboden.
Onlangs werden wij geconfronteerd met het feit dat de door ons gebruikte 4 ml glazen stolbuis van BD Diagnostics per direct niet meer geleverd kon worden. Dit ten gevolge van het algemene streven van leveranciers en laboratoria om uit veiligheidsoverwegingen af te stappen van het gebruik van breekbare glazen buizen. Als alternatief product werd een plastic stolbuis met clot activator voorgesteld. Dat de productie van de glazen buizen op termijn zou stoppen was tijdig door de fabrikant aangekondigd. Binnen diverse AMC-laboratoria, waaronder het Laboratorium voor Algemene Klinische Chemie, waren al diverse verificaties uitgevoerd voor het nieuwe type buis. Daarbij is in eerste instantie echter niet gedacht aan de hemocytometrie, dit is immers geen gangbaar type buis voor dit bepalingenpakket. De plastic stolbuis bevat echter, in tegenstelling tot de glazen buis, een additief. Het plastic oppervlak alleen is niet voldoende om binnen een acceptabele tijd het monster te laten stollen. Plastic stolbuizen bevatten daarom een stollingsactivator in de vorm van silicadeeltjes, die zichtbaar zijn tegen de wand van de buis. Hierbij rees de vraag of deze stollingsactivator van invloed zou kunnen zijn op de hemocytometriebepalingen en in het bijzonder de celtellingen. Mogelijk raken de deeltjes los van de wand en interfereren zij met de tellingen in het impedantiekanaal of andere meetkanalen. Om dit te toetsen werd besloten tot een korte verificatie van de plastic stolbuis voor de geschetste toepassing door middel van een vergelijkend onderzoek.
Materialen en methoden
Afnamebuizen
Voor dit onderzoek werden afnamebuizen gebruikt van de firma BD Diagnostics (Verenigd Koninkrijk): glazen stolbuis BD Vacutainer 367624, plastic stolbuis BD Vacutainer Plus 369032, EDTA-buis BD Vacutainer 368861.
Automatische celteller
Alle metingen werden uitgevoerd op een XN-20 celteller van Sysmex (Sysmex Corporation, Japan). Monsters werden gemeten in WBC + diff + Reti + PLT-F-modus.
Patiëntenvergelijkingen
Patiëntenvergelijking werden als volgt uitgevoerd. Per meting werd een twintigtal (verse) routine EDTA-monsters direct (binnen 60 minuten) na het bepalen op de Sysmex XN20 overgeschonken in een plastic of glazen stolbuis en opnieuw in de automatische modus aan dezelfde celteller aangeboden Voor de vergelijkingstoets werden de criteria gehanteerd zoals vermeld in Tabel 1. De in de tabel vermelde criteria worden in ons laboratorium standaard toegepast voor alle patiëntenvergelijkingen ten behoeve van de onderlinge afstemming van onze drie afzonderlijke XN celtellers. Deze vergelijkingen (met 5 monsters) tussen de celtellers worden minimaal twee keer per week uitgevoerd. Ook na onderhoud of kalibratie worden dergelijke vergelijkingen uitgevoerd (met 10 of 20 monsters). De criteria zijn vastgesteld bij de originele verificatie van de apparatuur en worden in de praktijk zonder problemen gehaald. Ook in de weken en dagen voorafgaand aan de verificatie was dit zonder uitzondering het geval. De gehanteerde criteria zijn vanzelfsprekend ook toepasbaar bij het vergelijken van resultaten binnen één celteller.
Resultaten
EDTA- versus plastic stolbuis
In de vergelijking tussen de EDTA- en de plastic stolbuis werd niet voor alle parameters voldaan aan de door ons gehanteerde criteria van de patiëntenvergelijking (zie Tabel 1). De diverse celtellingen leverden geen verschillen op. Er lijkt derhalve geen sprake te zijn van interferentie door de stolactivator op de telling van de leukocyten (totaal en differentiatie), trombocyten of erytrocyten. Ook de bezinking vertoonde geen significante afwijkingen ten opzichte van het originele resultaat (resultaten niet getoond).
Voor het MCV werd echter een significant verschil gezien tussen de meting in de EDTA-buis versus de plastic stolbuis, namelijk -1,2%. Opvallend hierbij is dat de twee parameters waaruit het MCV berekend wordt, het hematocriet (Ht) en het aantal erytrocyten (RBC), volgens onze criteria geen significant verschil vertoonden ten opzichte van de uitgangswaarden (Ht -0,4% en RBC +0,8%).
Dat de bevinding betreffende het MCV geen meetfout betreft, werd bevestigd door het experiment nog drie maal te herhalen met een twintigtal buizen. Hierbij werd telkens opnieuw een daling van het MCV waargenomen, variërend van -0,9 tot -2,2%. Opnieuw voldeden alle overige parameters wel aan de criteria voor de vergelijking. Ook in deze herhaalde experimenten werd een consistent patroon gezien wat betreft de resultaten voor het hematocriet en de erytrocyten: een niet-significante daling van het Ht (-0,2 tot -0,9%) en een eveneens niet-significante stijging van de RBC (+0,7 tot +1,3%). Voor de overige parameters werd alleen voor het Hb een consistente trend waargenomen, een stijging van +1,0 tot +1,3%, maar ook deze stijging was niet significant (Tabel 1).
Het gevonden effect op het MCV werd niet versterkt door de buizen gedurende 4 uur te incuberen bij kamertemperatuur. In de plastic stolbuizen bleven de metingen (alle parameters) stabiel ten opzichte van de originele metingen direct na het overgieten. Ook in de EDTA-buizen traden na 4 uur (zonder overschenken) geen significante verschillen op ten opzichte van de metingen op t=0 (resultaten niet getoond).
EDTA versus glazen stolbuis
Bovenstaande bevinding leidde tot de vraag in hoeverre dit effect veroorzaakt werd door het overschenken in een plastic stolbuis. Mogelijk wordt een zelfde effect gezien bij overschenken in de traditionele glazen stolbuis. De eerlijkheid gebiedt te vermelden dat dit nooit eerder was getest. Er werd besloten dit alsnog te doen. Volgens dezelfde methode werd een vergelijking uitgevoerd met een twintigtal monsters. In deze vergelijking werd hetzelfde patroon gezien als bij de vergelijking tussen EDTA- en plastic buis: alle parameters behalve het MCV vielen binnen de grenzen. Het gemeten verschil voor het MCV bedroeg -2,0%. Ook dit experiment werd ter bevestiging een keer herhaald, met hetzelfde resultaat (MCV -2,2%). Voor het Ht en de RBC werden dezelfde trends waargenomen als in de plastic stolbuis. Op basis van deze test is geconcludeerd dat het gevonden effect op het MCV optreedt na overschenken in alle typen stolbuizen, ongeacht of deze van glas of plastic zijn.
EDTA vacuüm versus EDTA na ontluchten
Het feit dat de daling van het MCV werd waargenomen in zowel de plastic als de glazen stolbuis, deed bij ons de vraag opkomen of het effect mogelijk onafhankelijk is van het type buis waarin het materiaal wordt overgeschonken, maar door de handelingen bij het overschenken zelf wordt veroorzaakt. Mogelijk is de oorzaak voor het effect gelegen in het opheffen van het vacuüm in de buis bij het verwijderen van de dop. Dit is getest in het volgende experiment. Van een twintigtal EDTA-monsters werden wederom alle parameters gemeten. Direct na de meting werden de monsters ontlucht door het verwijderen en weer terugplaatsen van de doppen, waarna opnieuw gemeten werd. Na deze procedure vielen alle parameters voor en na het opheffen van het vacuüm ruim binnen de criteria (zie Tabel 1). De gemeten waarden bleken zelfs dusdanig reproduceerbaar dat dit experiment opnieuw lijkt te bevestigen dat het effect op het MCV geen toevallige afwijking betreft.
Discussie
Zoals blijkt uit deze studie veroorzaakt het overschenken van EDTA volbloed in een plastic of glazen stolbuis een significante daling van het MCV. Over hoe het overschenken van bloed van een EDTA-buis naar een plastic of glazen stolbuis een daling van het MCV veroorzaakt, kunnen wij enkel speculeren.
De waarden voor het MCV, zoals deze door de XN celtellers worden geproduceerd, zijn geen direct gemeten waarden. Deze parameter wordt berekend uit het Ht en de RBC volgens de formule: MCV (fL) = Ht / RBC. Een verschuiving in de waarde van het MCV moet dan ook direct terug te voeren zijn op de meting van het Ht en/of de RBC. In de vergelijking van deze parameters, alhoewel de verschillen niet significant waren, werden consistente trends waargenomen van toenemende erytrocytenaantallen en een dalend hematocriet. Gezamenlijk veroorzaken de geringe verschuivingen in deze twee parameters wel een significante daling van het MCV.
De erytrocyten worden gemeten volgens de impedantiemethode, waarbij het passeren van een cel door de meetopening van het impedantiekanaal een elektrische puls veroorzaakt. De initiële aanleiding voor dit onderzoek was de gedachte dat de silicadeeltjes die als stollingsactivator op de wand van de plastic buis zijn aangebracht, zouden kunnen loslaten en de celtellingen zouden kunnen verstoren. Dit kan echter geen verklaring zijn voor de geobserveerde trend van licht gestegen aantallen RBC, aangezien dit fenomeen ook werd waargenomen in de originele glazen stolbuizen waaraan geen activator is toegevoegd. Een daadwerkelijke toename van het aantal deeltjes in de buizen lijkt dan ook niet waarschijnlijk.
Het hematocriet zoals gemeten op de XN20 is direct gebaseerd op het volume van de erytrocyten. Het wordt bepaald door middel van de cumulatieve ‘puls hoogte’-methode (1). Per cel wordt de hoogte van de elektrische puls gemeten als deze de meetopening passeert in het impedantiekanaal, waarbij de aanname is dat deze pulshoogte proportioneel is aan het volume van de cel. Daarmee is het Ht een waarschijnlijkere kandidaatveroorzaker van het gevonden effect op het MCV. De waargenomen daling van het Ht zou dan duiden op een daadwerkelijk gedaald volume van de rode bloedcellen. Voor onze studie zou dit betekenen dat de rode bloedcellen na het overschenken in een stolbuis een dusdanige conformatieverandering ondergaan dat dit resulteert in een kleiner volume van de cellen. Aangezien dit zowel optrad bij overschenken in een plastic en een glazen stolbuis, leek dit in eerste instantie meer op een effect van het overschenken zelf te duiden, dan op een effect van het materiaal van de buis waarin wordt overgeschonken. Wij speculeerden dat het effect niet zozeer veroorzaakt wordt door het overschenken, maar door het opheffen van het vacuüm in de afnamebuis. Men zou zich kunnen voorstellen dat erytrocyten die zich in een vacuüm afnamebuis bevinden wat opzwellen ten gevolge van de onderdruk in de buis. Bij het verwijderen van de dop (en daarmee het opheffen van het vacuüm) zouden de cellen naar hun oorspronkelijke staat terugkeren en weer wat inkrimpen, met een afname van het Ht en het MCV tot gevolg Deze theorie kon echter niet worden bevestigd in het experiment waarbij de EDTA buizen werden ontlucht.
Het lijkt moeilijk voorstelbaar dat puur de handeling van het overschenken een conformatieverandering van de erytrocyten veroorzaakt. De fysieke krachten waaraan de cellen worden blootgesteld tijdens het overschenken lijken verwaarloosbaar wanneer men deze vergelijkt met die waarmee de cellen te maken krijgen als het bloed door de naald in de vacuümbuis stroomt ten tijde van de afname. Het effect op het MCV bleek ook niet reversibel. Ook na 4 uur ‘rusten’ van de erytrocyten in de stolbuizen werd de daling van het MCV waargenomen. Dit pleit eveneens tegen een door het overschenken veroorzaakte conformatieverandering. Wij verklaren de daling van het MCV dan ook als een direct gevolg van de stolbuizen op het materiaal. Het effect is reproduceerbaar en wordt niet veroorzaakt door het opheffen van het vacuüm of het overschenken zelf.
Vervolgens rest de vraag in hoeverre de bevindingen relevant zijn in de dagelijkse praktijk. Alhoewel een verschil van 1-2% in het MCV niet heel groot is, beoordelen wij dit als klinisch significant, aangezien dit zich in de praktijk vertaalt als een afwijking van 1-2 fL. Zoals gemeld streven wij er binnen ons laboratorium naar om de verschillende celtellers minder dan 1% van elkaar te laten afwijken voor deze parameter. Ook voor de externe QC-resultaten wordt een maximaal toelaatbaar verschil van 1% gehanteerd ten opzichte van de consensusuitslagen. Voor de individuele patiënt kan een daling in het MCV van 1-2 fL immers het verschil maken tussen wel of niet binnen de referentiewaarden vallen, met mogelijke gevolgen voor therapie.
Wat zijn nu de consequenties van deze bevinding? Wij achtten het als laboratorium niet gewenst om op basis hiervan geen afwijkende formaten EDTA-buizen voor hemocytometrie te accepteren, aangezien dit onnodige extra bloedafnames voor de patiënten zou betekenen. Overschenken blijft derhalve af en toe noodzakelijk. Het overschenken in bloedafnamebuizen met een septumdop heeft, zoals hierboven geschetst, logistieke voordelen en is veiliger (voorkomen van morsen van potentieel infectieus materiaal in de apparatuur). Besloten is om de plastic stolbuizen wel te gaan gebruiken. Voor het merendeel van de parameters levert dit immers geen problemen op en de buizen zijn ook geschikt voor celtellingen in niet-volbloedmonsters. In die gevallen dat er ook een MCV is aangevraagd, zal de uitslag worden voorzien van een standaard commentaarcode om de aanvrager erop te attenderen dat het MCV minder betrouwbaar is ten gevolge van het overschenken uit een grote buis. De hoop is dat dit tevens een leereffect heeft richting de aanvragers en zal bijdragen aan het terugdringen van het aantal buizen van afwijkend formaat dat wordt aangeleverd voor hemocytometrie.
Conclusie
De resultaten van de beschreven verificatie bevestigen dat testen van nieuwe typen afnamebuizen in de eigen praktijk noodzakelijk blijft, voor alle mogelijke toepassingen (2). Daarbij dient men tevens bedacht te zijn op (al dan niet nieuwe) toepassingen van laboratoriumbuizen in algemene zin, waarbij het materiaal waarvan deze geconstrueerd zijn invloed kan hebben op de te testen parameters.