Vals verlaagde HbA1c in drager van Hb-Muravera; het belang van Hb-typering en patiënt-labeling in HbA1c-diagnostiek

Korte samenvatting

HbA1c is een goede parameter voor het vervolgen van de glycemische status van diabetici. Het geeft informatie over het juist instellen van de patiënt met behulp van medicatie en geeft de kans op complicaties op de lange termijn weer. Doordat het aantal patiënten met diabetes mellitus type 2 stijgt, neemt het aantal HbA1c-aanvragen toe. Er zullen daarbij meer hemoglobinevarianten gezien worden. Hier beschrijven we een patiënt met diabetes mellitus en de Hb-Muravera-variant waarbij we een vals verlaagde HbA1c-waarde hebben gemeten met de Tosoh G8. We beschrijven het belang van het kennen van de invloed van hemoglobinevarianten op de gebruikte HbA1c-methode in het laboratorium en adviseren het labelen van dergelijke patiënten om een juiste HbA1c-waarde te kunnen vervolgen.

Casus

Deze casus betreft een 67-jarige vrouw van Surinaamse afkomst, bekend met diabetes mellitus type 2 en hypertensie. Tussen 2000 en 2010 werden bij deze vrouw nuchtere glucosewaarden bepaald, zowel gemeten in volbloed als in plasma. De glucose-uitslagen in deze periode kenden een gemiddelde van 8,1 mmol/L, fluctuerend tussen 6,0 en 9,3 mmol/L. In 2010 is er voor het eerst een geglyceerde hemoglobine, HbA1c-onderzoek, aangevraagd. Dit resulteerde in een uitslag van 52 mmol/mol (Variant 2 turbo, Biorad, Hercules, VS) bij een op dat moment nuchtere glucose van 5,7 mmol/L.

Tijdens haar halfjaarlijkse diabetescontrole werd in september 2014 een waarde van 38 mmol/mol HbA1c gemeten (Tosoh G8, Tosoh Bioscience Inc., San Francisco, VS) bij een op dat moment nuchtere glucosewaarden van 7,2 mmol/L. Gezien het feit dat de HbA1c van mevrouw tussen 2010 en 2013 tussen de 51 en 61 mmol/mol lag, werd een daling naar 38 mmol/mol in HbA1c ondanks een tussenperiode van circa 7 maanden als opmerkelijk ervaren.

Gedurende de periode 2010 tot 2014 heeft deze mevrouw een microcytaire anemie bij een ijzergebrek (ferritine 5 µg/L), waarvoor ze meermaals behandeld is met ijzerinjecties. De patiënte was verder niet bekend met een hemoglobinopathie of andere oorzaak voor een verhoogde rode bloedcel-turnover.

Gezien het grote verschil in HbA1c werd middels capillaire elektroforese de hemoglobinefractie onderzocht (Hb-modus; Capillarys 2, Sebia, Evry, Frankrijk). Hierbij is een Hb-variant van circa 33% gevonden in de S-zone van het electroferogram, zie Figuur 1A. Middels Sanger sequentieanalyse van het β-globine-gen is dragerschap van een hemoglobine variant van de β-globineketen aangetoond, Hb-Muravera genaamd (HBB: c.143A>T, p.Asp47Val).

Bespreking

Diabetes mellitus

Diabetes mellitus wordt gekenmerkt door chronische hyperglycemie dat op de lange termijn resulteert in diverse complicaties zoals neuropathie, retinopathie en nefropathie. Diabetes mellitus type 2 is een wereldwijde epidemie onder andere door veranderingen in leefstijl, waaronder een toename van calorische inname en afname van beweging (1). Diverse studies hebben de link tussen diabetische complicaties en de gemiddelde glucosewaarde aangetoond. Dit heeft het controleren van de glycemische status van diabetici middels HbA1c waardevol gemaakt (2). Een verlaging van het HbA1c bij diabetici reduceert op de lange termijn de microvasculaire complicaties en is daarom een belangrijke focus van de behandeling (3).

HbA1c

HbA1c weerspiegelt de gemiddelde bloedglucosewaarde over een periode van de voorgaande twee tot drie maanden, afhankelijk van de levensduur van de erytrocyten. HbA1c is een non-enzymatische glyceerde hemoglobine waar glucose specifiek gebonden is aan de N-terminale valine van de ß-globineketen (2). Het kan gescheiden worden van de andere hemoglobinevarianten met behulp van diverse technieken zoals immunochemie, boronaat affiniteit chromatografie, HPLC en capillaire zone-elektroforese. HbA1c vormt een klein percentage van de totale Hemoglobine A en dit percentage is verhoogd aanwezig bij diabetici.

Hemoglobinopathieën en de Hb-Muravera-variant

De volwassen hemoglobine bestaat uit tetrameren van hemoglobineketens: HbA0 (α₂ß₂, circa 97.5%), HbA2 (α₂δ₂, circa 2.5%) en HbF (α₂γ ₂, circa 0.5%). Hemoglobinopathieën zijn afwijkingen in de aanmaak of functionaliteit van de hemoglobineketens, respectievelijk de thalassemieën en hemoglobinevarianten. Deze laatste worden in de meeste gevallen veroorzaakt door mutaties in exonen van het α- en ß-globine-gen. De meest voorkomende variant is HbS, de veroorzaker van sikkelcelziekte. Er zijn echter meer dan 1.200 verschillende hemoglobinevarianten beschreven. Over het algemeen vertonen dragers van varianten weinig tot geen symptomen. Compound heterozygotie of homozygotie kan echter bij bepaalde varianten leiden tot ernstige hemolytische anemie al of niet gekenmerkt door transfusieafhankelijkheid.

Hb-Muravera, de variant in deze casus, is voor het eerst beschreven in 2002 in Muravera op het eiland Sardinië (4). In het β-globine-gen op chromosoom 11 is een mutatie aanwezig in exon 2 codon 47 GAT>GTT (HBB: c.143A>T, p.Asp47Val), resulterende in substitutie van het aminozuur aspargine door valine. Het effect van deze aminozuursubstitutie is dat deze Hb-variant een verhoogde affiniteit heeft om zuurstof te binden ten opzichte van HbA. Het bloedbeeld wordt gekenmerkt door een mild microcytair beeld (MCV van circa 78 fL) en een normaal hemoglobinegehalte. Er zijn geen klinische consequenties bekend.

HbA1c en hemoglobinevarianten

Doordat HbA1c gerelateerd wordt aan de HbA-fractie in de meting, kunnen Hb-varianten interfereren. Doordat er diverse technieken gebruikt worden voor het bepalen van hemoglobinefracties, kan de HbA1c-uitslag verschillend beïnvloed worden door de aanwezigheid van Hb-varianten (2,5).
Immuunassays maken gebruik van een antilichaam tegen het geglyceerde N-terminale deel van de ß-globineketen, waardoor er weinig interferentie van gebruikelijke Hb-varianten ondervonden wordt. Door de manier van detecteren meet deze methode geen Hb-varianten. Bij boronaat affiniteit chromatografie reageert m-aminophenylboronaatzuur specifiek met cis-diol-groepen van glucose, gebonden aan hemoglobine. Ook hier is er minimale interferentie van Hb-varianten. HPLC en capillaire zone-elektroforese scheiden op basis van lading en detecteren de meeste Hb-varianten, maar zijn daarom gevoelig voor interferentie, mogelijk resulterend in een onder- of overschatting van HbA1c (6).

Bij zowel HPLC als capillaire zone-elektroforese worden de HbA0 en de HbA1,waaronder HbA1c, van elkaar gescheiden. Op deze manier wordt het gedeelte HbA1c bepaald ten opzichte van het totaal HbA. Er zijn verschillende Hb-varianten die bij gebruik van kation-uitwisselingschromatografie samenvallen met de HbA0-piek zodat er vals verlaagde HbA1c-waarden worden gemeten. Ook bestaan er Hb-varianten die samenvallen met de HbA1c-piek waardoor er vals verhoogde waarden worden gemeten. Daarnaast kan ook de geglycosyleerde versie van een variant wel of niet met de HbA1c-piek samenvallen en voor een over- of onderschatting van HbA1c zorgen.

De variant Hb-Muravera heeft invloed op de lading van hemoglobine doordat het aminozuur valine apolair is bij pH 7. Bij een aantal methodes verdwijnt deze variant onder de HbA0-piek. De piek kan ook een langere retentietijd hebben en achter de HbA0 migreren.

Vervolg

Bij de patiënte is tussen 2010 en 2013 de HbA1c gemeten middels HPLC op de Variant 2 turbo (Biorad, Hercules, VS). In september 2013 is de diagnostiek van HbA1c van de Variant 2 turbo overgegaan naar de Tosoh G8 (Tosoh Bioscience Inc., San Francisco, VS), waarbij HbA1c ook middels HPLC gescheiden wordt. Deze verandering verklaart het grote verschil dat gezien werd in 2014 ten opzichte van eerdere metingen. Bij de Tosoh G8 migreert de Hb-Muravera hetzelfde als de HbA0-piek (Figuur 1C). Hierdoor wordt bij berekening van HbA1c gedeeld door een groter getal (HbA plus Hb-Muravera), waardoor er een onderschatting van circa 30% HbA1c gemaakt wordt. De geglycosyleerde versie van de Hb-Muravera valt waarschijnlijk vlak voor de HbA0, gezien de toename in oppervlakte van deze piek in vergelijking met patiënten zonder een Hb-variant (Figuur 1B).

Tijdens de confirmatie van deze uitslagen werd in overleg besloten om vervolgdiagnostiek in te zetten waarbij een Hb-variant ontdekt werd middels capillaire elektroforese (Capillarys 2). De Hb-variant werd hierbij gekarakteriseerd als Hb-Muravera door middel van Sanger sequentieanalyse. Deze Hb-variant heeft klinisch beperkte consequenties. Het kan echter, afhankelijk van de gebruikte methode voor de HbA1c-meting, gevolgen hebben voor de interpretatie van de gemiddelde glycemische status van de patiënt, zoals bleek uit de vals verlaagde status, gemeten met de Tosoh G8.

Routine HbA1c-bepalingen worden in ons laboratorium volautomatisch middels HPLC op de Tosoh G8 bepaald. Indien er een afwijkend chromatogram of een foutmelding verschijnt, wordt de HbA1c bepaald middels capillaire elektroforese op de Minicap Flex Piercing (Sebia, Evry, Frankrijk). In het geval van een Hb-Muravera-variant komt deze gescheiden van de HbA0 te liggen en lijkt ook de geglycosyleerde versie van de Muravera apart te liggen doordat er nog een extra piek waarneembaar is in vergelijking met patiënten zonder Hb-variant (Figuur 1D). Hierdoor kan er een juiste HbA1c gerapporteerd worden.

In dit artikel beschrijven we deze patiënt met een Hb-Muravera-variant om het probleem van interferentie door Hb-varianten op HbA1c-bepalingen onder de aandacht te brengen. Het betreft echter niet alleen de Hb-Muravera, maar meerdere varianten zoals bijvoorbeeld Hb-Coushatta (2 patiënten), HbJ-Baltimore (18 patiënten), HbJ-Habana (1 patiënt), Hb-Okayama (1 patiënt), Hb-Riccarton (11 patiënten), Hb-Moabit (1 patiënt), Hb-Petit Bourg (1 patiënt), Hb-Osu Christianborg (2 patiënten) en anderen (niet gepubliceerd eigen data). Per variant is aangegeven hoeveel diabetische patiënten er met deze variant in onze HbA1c-populatie naar ons weten bekend zijn. Het merendeel van deze Hb-varianten vallen onder de HbA0- of HbA1c-piek. Naast deze minder voorkomende Hb-varianten kan ook de veelvoorkomende Hb-E-variant (circa 20) van invloed zijn op de HbA1c-bepaling (7).

In een aantal gevallen zal de apparatuur zelf een waarschuwing geven als er een extra piek gedetecteerd wordt. Monsters met extra pieken achter de HbA0, hebben meestal geen invloed op de HbA1c uitslag. Indien er pieken met een vergelijkbare of kortere retentietijd dan HbA0 aanwezig zijn, heeft dit meestal wel invloed op de HbA1c uitslag. Om een betrouwbare HbA1c-uitslag te kunnen genereren, is het daarom van belang dat deze middels een andere methode bepaald wordt. Uit deze casus blijkt dat er beslist niet bij alle varianten een waarschuwing door het apparaat gegeneerd wordt. Het is daarom essentieel dat elk laboratorium weet welke Hb-varianten van invloed zijn op de HbA1c-bepalingsmethode die gebruikt wordt. Ondanks het gebruik van een zelfde methode kunnen de varianten verschillend reageren. Overzichten van deze invloeden op de diverse methodes en apparaten zijn beschreven in diverse artikelen (5,7). In ons informatiesysteem worden dergelijke patiënten gelabeld en wordt de HbA1c handmatig op een ander systeem bepaald (Minicap Flex Piercing, Sebia, Evry, Frankrijk). Deze methode is gebaseerd op capillaire elektroforese, waardoor er bij de meeste varianten geen interferentie optreedt.

Het belang van het labelen van de patiënten in plaats van het reageren op flaggings van apparatuur wordt eveneens duidelijk bij patiënten met de hemoglobinevariant Hb-Coushatta, waarbij er op de Tosoh G8 bij dezelfde patiënt wisselend wel of geen waarschuwing wordt gegenereerd door de software. Dit komt doordat de plek van de geglycosyleerde versie van de Hb-Coushatta verschilt en de ene keer op de glyco-E plek komt en de andere keer een gelijke retentietijd als de schouder van de HbA1c-piek heeft. Dit minimale verschil in retentietijd kan verklaard worden door variabelen in de HbA1c-meting zoals het lotnummer van het reagens en de buffer, het aantal injecties op de kolom, en in ons laboratorium het meten op twee verschillende apparaten.

Conclusie

HbA1c is een goede parameter voor het vervolgen van de glycemische status van diabetici. Het geeft informatie over het juist instellen van de patiënt met behulp van medicatie en geeft de kans op complicaties op de lange termijn weer. Doordat het aantal patiënten met diabetes mellitus type 2 stijgt en daarmee het aantal HbA1c-aanvragen, neemt ook het aantal patiënten met diabetische mellitus én een hemoglobinopathie toe. Voor laboratoria is het belangrijk om de invloed van diverse varianten op de gebruikte apparatuur voor de HbA1c-bepaling te kennen. Daarbij is het belangrijk om bij signalen van de apparatuur en bij discrepanties tussen HbA1c en gemeten glucose vervolgonderzoek in te zetten naar eventuele Hb-varianten. Het advies is om de HbA1c bij deze patiënten met een andere methode te bepalen. Daarbij wordt sterk aanbevolen om patiënten met Hb-varianten in het laboratorium-informatiesysteem te labelen, zodat extra aandacht besteed kan worden aan het generen van de juiste HbA1c-uitslag van de patiëntengroep.

Dankbetuiging

We bedanken dr. ing. C.L. Harteveld voor zijn hulp bij het beschrijven van deze casus.