Foutief verhoogde uitslagen voor eiwit met een urinestrip als gevolg van een verhoogde pH: een omvanganalyse

Samenvatting

De verstorende invloed van een hoge pH van urine op de kwalitatieve bepaling van eiwit met de urinestrip is algemeen bekend. Hoe vaak foutieve uitslagen voorkomen en hoe groot die fout is, is niet duidelijk. Met een retrospectieve data-analyse hebben wij van 1.610 urinescreeningen met pH ≥ 8,0 en een positieve eiwituitslag de oorspronkelijke en pH-gecorrigeerde eiwituitslagen geanalyseerd. Uit de analyse blijkt dat bij 29 procent van deze resultaten de eiwituitslag significant verschillend was. Hieruit concluderen wij dat de kwaliteit van de kwalitatieve eiwitbepaling bij pH ≥ 8,0 onvoldoende is. Daarnaast blijkt uit een enquête dat de meeste laboratoria hier geen specifieke procedure voor hebben ingericht. Gezien de frequentie en omvang van de meetfout strekt het tot de aanbeveling om in het geval van een positief resultaat voor eiwit in urine bij pH ≥ 8,0 de kwalitatieve eiwituitslag te laten vervallen, en eventueel de albumine/kreatinine-ratio te bepalen.

Inleiding/probleemstelling

De interferentie van een verhoogde pH in de kwalitatieve eiwitbepaling met de urinestrip is al decennia bekend en wordt door de producenten van deze tests in bijsluiters en literatuur beschreven (1,2). Echter, een duidelijke onderbouwing wat betreft de omvang van deze analytische fout en vanaf welke pH deze fout precies optreedt, ontbreekt tot op heden.

Er bestaan verschillende factoren die de pH van urine kunnen beïnvloeden. De nieren spelen, samen met de longen, een zeer belangrijke rol bij het in stand houden van het zuur-base-evenwicht in het lichaam. Via de longen wordt CO₂ uitgeademd, in de nieren wordt overtollig H⁺ via de urine uitgescheiden in de vorm van NH₄⁺, HPO₄^2- en zwakke organische zuren, terwijl bicarbonaat in de tubuli wordt geresorbeerd. Een normale (ochtend)urine is licht zuur tot neutraal, met een pH tussen 5 en 6 (1). Direct na de maaltijd is de urine vaak iets basisch (pH 8) doordat er dan een verhoogde productie van maagsap (maagzuur) plaatsvindt met een verminderde renale excretie van H⁺ tot gevolg. Een dieet rijk aan dierlijke eiwitten geeft een zuurdere urine, een dieet hoofdzakelijk bestaand uit groenten geeft een meer alkalische urine (1). Hiernaast kan medicatie de pH van urine beïnvloeden. Bij een urineweginfectie kan de ochtendurine onder invloed van bacteriën basisch zijn en bij diabetes mellitus (door verhoogde vetzuurverbranding) en diarree (door gastro-intestinaal verlies van bicarbonaat) kan de urine extra zuur worden.

De aanwezigheid van eiwit in urine is vaak een teken van nierschade. De hoeveelheid eiwit in urine is daarbij een indicatie voor de ernst van de nierschade, alsmede een prognostische factor voor de progressie van nierschade (3). Voor het omschrijven van de aanwezigheid van eiwitten in urine worden de termen albuminurie en proteïnurie gebruikt. Bij een urinaire uitscheiding van 30-300 mg albumine per 24 uur spreekt men van micro-albuminurie en bij een uitscheiding groter dan 300 mg albumine per 24 uur van macro-albuminurie. Proteïnurie (albumine en/of andere eiwitten) wordt als pathologisch beschouwd vanaf een uitscheiding van meer dan 500 mg eiwit per 24 uur (4). Oorzaken van nierschade die leiden tot eiwitverlies zijn afwijkingen in het glomerulaire filter, verminderde tubulaire resorptiecapaciteit of gemengde oorzaken, en aandoeningen waarbij de kwaliteit van de bloedvaten wordt aangetast zoals hypertensie en diabetes. Ook kan proteïnurie optreden als gevolg van overproductie van eiwitten (bijvoorbeeld monoklonale immuunglobulines), waarbij de resorptiecapaciteit van de tubuli wordt overschreden. Tijdens de zwangerschap of bij grote fysieke inspanning kan een voorbijgaande proteïnurie optreden (5,6).

Volgens de richtlijnen is de albumine/kreatinine-ratio de aangewezen parameter voor het screenen en vaststellen van proteïnurie bij risicogroepen zoals diabetici en het opvolgen van eerder aangetoonde proteïnurie (7,8), maar de snelheid, eenvoud en lage kosten maken dat de urinestrip voor algemeen screenende doeleinden in de eerste- en tweedelijnszorg nog altijd een prominente rol in de routinediagnostiek speelt.

De bepaling van eiwit met de urinestrip is gebaseerd op het principe van de eiwitfout van een pH-indicator (broomfenolblauw) waarbij een verandering van kleur optreedt (2). In aanwezigheid van eiwit kunnen protonen (H⁺) van de indicator worden opgenomen door de vrije bindingsplaatsen voor H⁺ op de eiwitten, hetgeen dezelfde kleuromslag teweegbrengt als een verhoging van de pH (zie reactievergelijkingen hieronder). Dit houdt in dat bij een normale pH van het urinemonster op de teststrip onder invloed van eiwit een concentratieafhankelijke kleuromslag van geel naar blauwgroen plaatsvindt. Echter, bij een sterk basische urine kunnen protonen van de indicator opgenomen worden door de vrije basen in de urine, waardoor er onafhankelijk van de aanwezigheid van eiwitten een kleuromslag optreedt.

[indicator^--H⁺] _(geel) + eiwit → indicator^- _{(blauw-groen)} + [eiwit-H⁺]

[indicator^--H⁺] _(geel) + base → indicator^- _{(blauw-groen)} + [base-H⁺]

Om de juistheid van de eiwituitslag bij een hoge pH te controleren, werd bij het Reinier Haga Medisch Diagnostisch Centrum (RHMDC) tot kortgeleden een pH-correctie uitgevoerd indien de pH van een urinemonster ≥ 8,0 én het eiwit positief was. Al deze data werd opgeslagen in het LIS. Om de invloed van pH op de kwalitatieve eiwitbepaling in kaart te brengen werd deze data geëxtraheerd, en werd de (niet-gerapporteerde) eiwituitslag vóór correctie vergeleken met de (gerapporteerde) uitslag na correctie van de pH tot pH = 6.

Materiaal en methoden

In de dagelijkse routine werd de urinescreening uitgevoerd op een Siemens Clinitek urine analyser. Een negatieve uitslag bij een hoge pH (≥ 8,0) werd beschouwd als betrouwbaar en derhalve niet gecontroleerd. Bij een positieve eiwituitslag (spoor of hoger) in combinatie met een pH ≥ 8,0 werd het monster aangezuurd met enkele druppels HCl (2 M) tot pH 6,0 en werd de urinescreening met de teststrip in het aangezuurde urinemonster herhaald.

Alle resultaten van kwalitatief eiwit in urine, voor en na eventuele pH-correctie, en pH van de urinescreening over de periode 07-09-2015 t/m 31-12-2019 werden verzameld. Incomplete resultaten werden verwijderd waarna de resultaten met pH ≥ 8,0 geselecteerd werden. Het effect van de eiwitcorrectie bij verschillende pH-waarden werd in kaart gebracht. Om te controleren of het fenomeen van een vals verhoogde eiwituitslag ook niet al bij lagere pH optreedt, werden ter verificatie tweeëntwintig monsters met pH 7,0-7,5 en een positieve eiwituitslag verzameld. Bij deze monsters werd tevens de pH naar 6 gebracht en werd de invloed hiervan op de eiwituitslag geanalyseerd.

Om inzicht te krijgen in de gehanteerde werkwijze bij andere laboratoria in het land met betrekking tot de eiwitdiagnostiek bij een hoge pH in urine, werd onder de AIOS klinische chemie een enquête verspreid met enkele korte vragen. Indien er vanuit eenzelfde laboratorium meerdere reacties werden ontvangen, werden deze reacties als één respondent in de resultaten opgenomen. In deze enquête werden de volgende vragen gesteld:

1. Hoe wordt er gehandeld bij een positief resultaat voor eiwit bij een hoge pH in de urinescreening (strip)?
2. Wordt er bij een hoge pH een commentaartekst bij het eiwitresultaat gerapporteerd?
3. Wat wordt bij bovenstaande gedefinieerd als 'hoge pH'?
4. Wordt er, bij een positieve uitslag voor eiwit op de strip, routinematig/automatisch een kwantitatieve eiwitbepaling (chemie-analyzer) ingezet, en zo ja, welke test(en)?

Resultaten

Invloed hoge pH op eiwit in urine

De totale dataset bestond uit 142.956 monsters, waarvan 4% (5.522 monsters) met pH ≥ 8,0 (3.610 monsters pH = 8,0, 1.650 monsters pH = 8,5 en 262 monsters pH ≥ 9,0), zie Figuur 1A. Van de monsters met een hoge pH (gedefinieerd als pH ≥ 8,0) was in 29% (1.610 monsters) de eiwitscreening positief (gedefinieerd als spoor of groter). Na correctie van de pH naar pH = 6,0 bleek de eiwitscreening in slechts 14% (750 monsters) daadwerkelijk positief te zijn. Door het monster aan te zuren tot pH 6,0 wordt het monster weliswaar een fractie verdund, maar dit kan het waargenomen verschil in de eiwituitslagen niet verklaren. Afwijkingen binnen één kleurvlakje verschil werden (conform de bijsluiter) als niet-significant verschillend beschouwd. Van alle positieve uitslagen uit de dataset kwam 26% exact overeen met de oorspronkelijke uitkomst, en week 29% significant (twee kleurvlakjes of meer) af van het resultaat bij gecorrigeerde pH. Bij alle drie onderzochte pH-waarden was het percentage uitslagen dat twee kleurvlakjes afweek van de uitslag bij gecorrigeerde pH ongeveer gelijk (19,9%-24,6%). Echter de afwijking van drie kleurvlakjes of meer was bij een pH ≥ 8,5 beduidend hoger dan bij pH = 8,0 (11% en 4% respectievelijk), zie Figuur 1B. Een significant foutief verlaagde uitslag werd in geen enkel geval gevonden.

Om vast te stellen of het verstorende effect op de eiwitscreening ook al bij een pH < 8,0 optreedt, werden enkele aanvullende monsters verzameld voor een steekproef bij pH 7,5 (n = 11) en 7,0 (n = 11). Bij deze monsters werd in geen enkel geval een significant afwijkende uitslag gevonden (data niet weergegeven).

Landelijke enquête onder klinisch chemische laboratoria

Door middel van een enquête werd geïnventariseerd welke werkwijzen er in verschillende laboratoria in gebruik zijn, zie Figuur 2. Vanuit 21 laboratoria werd een reactie ontvangen. Dit betrof vijf laboratoria verbonden aan academische ziekenhuizen en zestien laboratoria verbonden aan perifere ziekenhuizen. Er werd geen correlatie gevonden tussen het type laboratorium en het gebruik van een bepaalde werkwijze. Door vier laboratoria wordt de bepaling van eiwit in urine met de teststrip niet aangeboden. Van de zeventien laboratoria die de urinestrip wel voor de eiwitscreening in gebruik hebben, rapporteren vijftien laboratoria (88 procent) in het geval van een hoge pH de oorspronkelijke, mogelijk vals verhoogde uitslag van de eiwitscreening. Van de twee laboratoria die de oorspronkelijke uitslag niet direct rapporteren, laat één laboratorium de uitslag vervallen vanaf pH ≥ 8,0 en het andere laboratorium rapporteert een gecorrigeerde uitslag bij monsters vanaf pH ≥ 8,5. Elf laboratoria (65 procent) rapporteren de uitslag zonder aangepaste werkwijze. Vier laboratoria (24 procent) rapporteren de oorspronkelijke uitslag wel, maar kiezen er daarnaast voor om automatisch een vervolgtest in te zetten. Deze vervolgtest wordt door hen bij alle positieve uitslagen voor eiwit gedaan, ongeacht de pH. Opvallend is dat deze vier laboratoria in een dergelijk geval allemaal een andere vervolgtest aanbieden. Conform de richtlijnen zou in het geval van (verdenking op) proteïnurie de albumine/kreatinine-ratio hiervoor de aangewezen bepaling zijn (7,8).

Eén laboratorium gaf aan tot recent een celtelling en urinesediment uit te voeren bij alle uitslagen eiwit 2+ (ongeacht de pH), maar bezig te zijn om de werkwijze aan te passen naar “geen aangepaste werkwijze”. Dit laboratorium is met de nieuwe werkwijze in de resultaten opgenomen. Een ander laboratorium gaf aan geen aangepaste werkwijze te hanteren met betrekking tot de pH, maar bij alle uitslagen eiwit ≥ 3+ automatisch de commentaartekst te rapporteren: “Proteïnurie, overweeg verwijzing naar nefroloog”. Onafhankelijk van de gekozen werkwijze gaven verschillende laboratoria aan dat de mogelijke interferentie van hoge pH op de eiwitscreening wel in de SOP wordt genoemd.

Discussie

In deze retrospectieve data-analyse werd de invloed van pH op de kwalitatieve eiwitbepaling met de urinestrip onderzocht. Het bestaan van dit effect is al geruime tijd bekend, echter de omvang hiervan is nooit duidelijk vastgesteld. Wel is er een studie beschreven waarin urines met behulp van NaOH, NaHCO₃ en Na₂CO₃  in vitro werden gealkaliseerd om het effect van pH op de eiwitscreening te onderzoeken (9). Dankzij de zeer grote dataset die met de (destijds) standaardwerkwijze in ons laboratorium in de loop der jaren werd opgebouwd, hebben wij nu voor het eerst op een groot aantal monsters de invloed van pH op de eiwitscreening kunnen analyseren. Hierbij werd aangetoond dat van de positieve eiwituitslagen bij pH ≥ 8,0 een groot percentage foutief verhoogd was, zie Figuur 1.

Uit de enquête is gebleken dat de meeste laboratoria geen specifieke werkwijze hebben ingericht voor de bepaling van eiwit in urine in het geval van een verhoogde pH, zie Figuur 2. Wel werd door verschillende laboratoria aangegeven dat de mogelijke interferentie van een hoge pH in de eiwitbepaling wordt benoemd in de SOP. Opvallend is dat de vier laboratoria die een automatische kwantitatieve reflextest hebben ingericht in het geval van een positieve kwalitatieve eiwituitslag, allen voor een andere vervolgtest kiezen.

De resultaten van de data-analyse laten zien dat het de aanbeveling verdient om kritisch te zijn op de positieve resultaten voor de kwalitatieve eiwitbepaling bij urines, wanneer de pH ≥ 8,0 is. Met een specificiteit van 93,6 procent en een relatief lage prevalentie van proteïnurie (1,2-9,1 procent), is de positief voorspellende waarde (34,6 procent) van de kwantitatieve eiwitbepaling slecht (10). Het afvangen van uitslagen bij pH ≥8,0, waarbij het aantal fout-positieve resultaten relatief groot is, zal de specificiteit en daarmee de positief voorspellende waarde van de test mogelijk iets verbeteren.

Er kan worden gedacht aan alternatieve methodes, zoals het aanzuren van de urine en herhalen van de kwalitatieve analyse, of het uitvoeren van een kwantitatieve bepaling. Deze alternatieven lijken echter niet kosteneffectief. Herhaling van de kwalitatieve analyse zorgt voor extra kosten voor het laboratorium, terwijl het automatisch toevoegen van een kwantitatieve analyse resulteert in extra laboratoriumkosten voor de patiënt. Ook in het kader van zinnige en zuinige diagnostiek is het niet aan te raden om de kwalitatieve bepaling in alle gevallen automatisch om te zetten in een kwantitatieve bepaling, omdat afhankelijk van de vraagstelling de aanvrager bij de aanvraag van een urinescreening niet per definitie geïnteresseerd is in het resultaat van de eiwitscreening. Zo is bijvoorbeeld bij verdenking urineweginfectie – een aandoening waarbij hogere pH-waarden ook juist meer frequent voor kunnen komen – volgens de LESA slechts screening van de urine op nitriet en leukocyten geïndiceerd (11). In plaats van een automatische alternatieve bepaling, is er daarom binnen ons laboratorium voor gekozen om de aanvrager door middel van een commentaartekst te adviseren om – indien gewenst – een nieuwe urine in te sturen met een aanvraag voor een albumine/kreatinine-ratio. Bij deze keuze werd tevens rekening gehouden met aanvragers die middels POCT-apparaten de urinescreening zelfstandig uitvoeren. Via de koppeling met het LIS kunnen de onbetrouwbare uitslagen ook in die gevallen worden gecorrigeerd, terwijl met de vroegere werkwijze (correctie van de pH en herhalen van de analyse) correctie van deze op afstand geproduceerde resultaten onmogelijk was.

Samenvattend is het percentage foutieve uitslagen bij pH ≥ 8,0 zodanig groot gebleken (24-35 procent), dat wij van mening zijn dat positieve eiwituitslagen bij dergelijke pH niet zonder meer gerapporteerd zouden moeten worden. In het bijzonder bij een pH van ≥ 8,5 waarbij minder dan 70 procent van de uitslagen correct bleek te zijn. Waar voor veel testen binnen de klinische chemie een arbitraire grens van 10 procent afwijking gehanteerd wordt als acceptabel, kunnen we concluderen dat deze test bij pH ≥ 8,0 van onvoldoende kwaliteit is.