Een vanadaatmethode voor bepaling van direct bilirubine met verminderde interferentie door hemolyse

Samenvatting

De meest gebruikte bepaling voor direct bilirubine, gebaseerd op de Jendrassik-Grof-methode, staat bekend om de gevoeligheid voor interferentie door hemolyse. In deze studie onderzoeken we of vanadaat reagens een bruikbaar alternatief is.

Patiëntmateriaal is hiervoor gespiked met een oplopende concentratie hemolytisch en lipemisch materiaal. Daarnaast is een patiëntvergelijk uitgevoerd in plasma van zowel volwassenen als neonaten.

De vanadaatmethode is minder gevoelig voor hemolyse dan de diazomethode met een afkapgrens voor hemolytische index van respectievelijk 235 vs. 16. Vergelijk van beide methodes vertoont een bias van -10% voor de vanadaatmethode t.o.v. de diazomethode. Vergelijk met neonaten geeft echter, na correctie voor hemolyse, een bias van +30%.

De vanadaatmethode is minder gevoelig voor hemolyse en daarmee een bruikbaar alternatief voor de diazomethode. De verschillen tussen de correlatie voor volwassen en neonaten worden waarschijnlijk veroorzaakt door het verschil in samenstelling van de bilirubinefracties. De mate van reactie van deze fracties is sterk afhankelijk van de gebruikte meetmethode.

Introductie

Bilirubine wordt continu gevormd door afbraak van erytrocyten. Het is een metaboliet van heem, een component van hemoglobine, myoglobine en cytochroom. Bilirubine is slecht oplosbaar en komt in bloed voornamelijk gebonden aan albumine voor. Conjugatie in de lever zorgt ervoor dat bilirubine oplosbaar wordt, waarna het in gal uitgescheiden kan worden. In de circulatie komt bilirubine voor in vier verschillende fracties: dit zijn de ongeconjugeerde fractie (α bilirubine) en de conjugeerde fracties; te weten mono-geconjugeerd (β), di-geconjugeerd (γ) en covalent aan albumine gebonden geconjugeerd bilirubine (δ-bilirubine). (1)
Diagnostisch wordt er onderscheid gemaakt tussen direct en indirect bilirubine. Dit onderscheid wordt gemaakt op basis van chemische eigenschappen van bilirubinefracties. Bij direct bilirubine reageren fracties zonder extra toevoegingen aan het gebruikte reagens, dit zijn over het algemeen de geconjugeerde fracties (β, γ en deels δ). (2) Direct bilirubine en geconjugeerd bilirubine zijn hiermee dus niet volledig identiek. (3) Toevoeging van reagentia als cafeïne, natriumbenzoaat of methanol, zorgt ervoor dat ook het ongeconjugeerde bilirubine reageert met het gebruikte reagens. Omdat hierbij alle fracties reageren wordt dit totaal bilirubine genoemd. In de praktijk worden alleen direct en totaal bilirubine bepaald. De indirecte bilirubine wordt vanuit deze bepalingen afgeleid (totaal bilirubine – direct bilirubine).
De oorzaken van een hyperbilirubinemie zijn met name een verhoogde afbraak van hemoglobine of een verminderde uitscheiding van bilirubine. (4) Een verminderde uitscheiding wordt vaak veroorzaakt door cholestase, waarbij het geconjugeerde bilirubine stijgt. (5) Bij een verminderde leverfunctie of een verhoogde afbraak van erytrocyten zal juist het ongeconjugeerd bilirubine verhoogd zijn.
Bij neonaten kan een fysiologische vorm van hyperbilirubinemie voorkomen. In de eerste dagen na geboorte worden relatief veel foetale erytrocyten afgebroken. Hierbij komen grote hoeveelheden bilirubine vrij. Vrijwel alle neonaten maken daarom een korte periode van ongeconjugeerde hyperbilirubinemie, met kenmerkende icterie, door. (3) De ernst hiervan is afhankelijk van de maturiteit en conjugatiecapaciteit van de lever en kan versterkt worden door erytrocytdefecten of bloedgroepincompatibiliteit. Wanneer er langdurige en extreem hoge concentraties bilirubine ontstaan, kan vrij bilirubine in de hersenen neerslaan met chronische bilirubine-encefalopathie, of kernicterus, tot gevolg. (6) Hoewel het maken van onderscheid tussen voorbijgaande en klinisch relevante hyperbilirubinemie complex is, kan een inschatting gemaakt worden op basis van het totaal bilirubine-normogram en de albumineconcentratie. (7, 8) Om adequaat te kunnen handelen bij een neonatale bilirubinemie wordt het bilirubine vervolgd met de bepaling voor totaal bilirubine. In de meeste gevallen zal de bilirubineconcentratie vanzelf dalen. Bij een ernstige bilirubinemie (100-200 kinderen per jaar) is fototherapie of wisseltransfusie (50-100 per jaar) noodzakelijk om kernicterus te voorkomen. (9, 10)
Hoewel zeer zeldzaam, kan de icterie bij neonaten ook veroorzaakt worden door een geconjugeerde bilirubinemie. Bij persisterende hyperbilirubinemie is het daarom van belang om een onderscheid te maken tussen indirect en direct bilirubine. Een geconjugeerde hyperbilirubinemie wordt overwogen bij een direct bilirubine / totaal bilirubine van >20%. (10) Geconjugeerde hyperbilirubinemie wordt met name veroorzaakt door cholestase, bijvoorbeeld bij (aangeboren) biliaire atresie. (5)
Zowel totaal- als direct bilirubine wordt in Nederland in de meeste gevallen op routine chemie-analyzers bepaald op basis van een diazo-reagens (gebaseerd op de Jendrassik-Grof methode). Hierbij reageert direct bilirubine met 3,5 dichlorophenyldiazonium zout. In een zure buffer zorgt dit voor het rode azorobilirubine, wat fotometrisch bepaald kan worden. Nadeel van deze bepaling is de gevoeligheid voor interferentie door hemolyse.
Evenals icterie en lipemie staat hemolyse bekend vanwege de interferentie bij met name fotometrische bepalingen. Hoge concentraties hemoglobine (hemolyse), vetten (lipemie) of bilirubine kunnen dan ook tot een sterk afwijkende uitslag leiden. Om de betrouwbaarheid van uitslagen te garanderen wordt de mate van lipemie, hemolyse en de bilirubine concentratie tegenwoordig mee bepaald tijdens het analytische proces. (11-13) Op basis hiervan kan besloten worden of een uitslag betrouwbaar gerapporteerd kan worden.
Bij onze huidige bepaling voor direct bilirubine van Roche (diazo-reagens, gebaseerd op de Jendrassik-Grof methode) zorgt hemolyse al bij een hemolytische index (H.I.) van 15,5 µmol/L voor >10% interferentie. In de praktijk wordt deze grens van 15,5 µmol/L met name bij afnames bij neonaten en kinderen snel overschreden. Uit intern onderzoek bleek dat bij een oplopende H.I.-index de mate van interferentie dusdanig opliep dat >50% van de bepalingen >10% afweken ten gevolge van hemolyse en dus afgekeurd zouden moeten worden.
Vanwege deze hoge mate van interferentie door hemolyse is besloten op zoek te gaan naar een andere, minder gevoelige, methode. In dit onderzoek beschrijven we de validatie van het vanadaat reagens. Dit reagens werkt op basis van oxidatie van bilirubine naar bilverdine en zou daarmee minder gevoelig moeten zijn voor hemolyse. (14) Het doel is om te onderzoeken of de bepaling van direct bilirubine bij neonaten met vanadaat reagens een betrouwbaar en bruikbaar alternatief is voor de huidige bepaling van direct bilirubine met diazo-reagens.

Materiaal en Methode

Reagentia en methode

Voor de verificatie van een bepalingsmethode voor direct bilirubine die minder gevoelig is voor interferentie door hemolyse bij neonaten, is diazo-reagens (Roche diagnostics, Basel, Zwitserland) met vanadaat reagens (Fujifilm Wako Chemicals, Neus, Duitsland) vergeleken.

Beide bepalingen zijn uitgevoerd op de Roche Cobas c501 (Roche diagnostics). De diazomethode is als bepaling beschikbaar via de leverancier (Roche diagnostics). Vanadaat reagens is geïnstalleerd op een open kanaal op basis van de aanwijzingen van de leverancier (Fujifilm Wako Chemicals).

In de diazomethode reageert direct bilirubine (geconjugeerd bilirubine en δ-bilirubine) met 3,5-dichlorophenyl diazonium zout in een zure buffer, waardoor azobilirubine ontstaat. De zo ontstane rode kleur is evenredig met de concentratie direct bilirubine en wordt fotometrisch bepaald bij 546 nm. Ditzelfde geldt voor de methode voor totaal bilirubine, hier wordt echter een sterk zuur aan het monster toegevoegd zodat niet alleen geconjugeerd en δ-bilirubine, maar ook de andere bilirubine fracties mee reageren. (15) De vanadaat methode gebruikt een combinatie van een detergens en vanadaat. Bij een pH van 3 leidt dit tot een oxidatie van bilirubine naar bilverdine en een vermindering van de absorptie van kenmerkende gele kleur van bilirubine. Deze afname wordt fotometrisch bepaald (bij 450 nm) en is omgekeerd evenredig met de concentratie direct bilirubine. (16)

Hemolyse en lipemie indices zijn bepaald op een Roche cobas chemie platform. De H-index (H.I.), L-index (L.I.) en I-index (I.I.) worden fotometrisch bepaald door bichromatische metingen op respectievelijk 570/600 nm, 660/700 nm en 480/505 nm. (17)

Precisie en juistheid

Ter verificatie van de bruikbaarheid van het vanadaat reagens is een vergelijk uitgevoerd met het huidige diazoreagens. Voor verificatie van de precisie werd een kort EP 15 protocol uitgevoerd. Hiervoor werden de controles op 2 niveaus (18,6 en 49,2 µmol/L) (Lyphocheck assayed chemistry quality control, Bio-rad, California, USA) voor beide reagentia 20 keer bepaald (5 dagen, 2 keer per dag in duplo).

Ter verificatie van de juistheid werd een patiëntvergelijk uitgevoerd op basis van EP-protocol 9. Hiervoor werd gebruik gemaakt van lithium-heparine plasma van volwassenen (n=40) en neonaten (n=30). Over een periode van 3 weken werden dagelijks monsters verzameld, waarna een direct bilirubine met beide methodes bepaald werd. Tussen de metingen zat nooit meer dan 2 uur tijdsverschil. Voor dit vergelijk is gebruik gemaakt van geanonimiseerd restmateriaal waarbij al een direct bilirubine bepaald was voor routinematige diagnostiek. Alle verzamelde data zijn met het EP Evaluator softwarepakket geanalyseerd (v11, Da­vid G. Rhoads Associates, Inc.).

Omdat er een groot verschil bleek te zijn voor de gevoeligheid voor hemolyse tussen de beide reagentia, is er bij het vergelijk in lithium-heparine plasma van neonaten gecorrigeerd voor de mate van hemolyse. Op basis van de resultaten van interferentie door hemolyse op direct bilirubine werd teruggerekend naar de verwachte concentratie zonder interferentie van hemolyse.

Indices

De door de firma’s geadviseerde afkapgrenzen voor interferentie van zowel lipemie als hemolyse zijn aangegeven in Tabel 1. Deze zijn voor de diazomethode gebaseerd op een maximale afwijking van 10 procent door interfererend materiaal. Voor de vanadaatmethode is onbekend wat de gebruikte maximale procentuele afwijking is. In deze studie hebben wij voor de maximale procentuele afwijking gebruik gemaakt van de desirable specification for inaccuracy (B (%)) uit de Desirable Biological Variation Database specifications tabellen. (18) Op basis hiervan is gekozen voor een maximale toelaatbare afwijking door interferentie van 14,2%.

Interferentie

Ter verificatie van de door de fabrikant geleverde afkapgrenzen voor de interferentie van hemolyse (hemolytische index, H.I.) en lipemie (lipemische index, L.I.) is deze interferentie getest met oplopende indices (H.I. en L.I.) bij verschillende concentraties van bilirubine.

Voor bepaling van de interferentie werd materiaal (Lipemie, n=5 en Hemolyse, n=15)) verzameld met zo laag mogelijke indices van de respectievelijke interferenten (L.I., H.I.). Hemolytisch materiaal werd gemaakt door een pellet van erytrocyten herhaaldelijk (5x) bloot te stellen aan een cyclus van vriezen, dooien en vortexen. Vervolgens werd patiëntmateriaal gespiked met een oplopende concentratie van het hemolytisch of lipemisch materiaal. Voor lipemie werd materiaal vertroebeld door toevoeging van een lipidenrijke oplossing (Nutrini, Nutricia). In deze monsters werd direct bilirubine gemeten en op basis van de verkregen interferentie-curves kon de interferentie van lipemie en hemolyse berekend worden.

Resultaten

Vanwege de hoge mate van interferentie van hemolyse op de bepaling van direct bilirubine werd besloten een andere methode te testen. Hiervoor zijn de effecten van hemolyse op de vanadaatmethode en de diazomethode vergeleken. Vervolgens is ook de invloed van lipemie getest en zijn de juistheid en reproduceerbaarheid gecontroleerd.

Interferentie hemolyse

Ter verificatie van de gerapporteerde afkapgrenzen voor hemolyse en lipemie is patiëntmateriaal met een lage hemolytische of lipemische index (<10) gespiked met hemolytisch (n=15) of lipemisch materiaal (n=5). Op basis van de zo verkregen oplopende L.I. en H.I. is de respectievelijke interferentie op de bepaling van direct bilirubine met beide methodes geanalyseerd.

Zoals aangegeven door de leveranciers toont deze studie dat de diazomethode gevoeliger is voor interferentie van hemolyse dan de vanadaatmethode (Figuur 1A). Waar de diazomethode zelfs bij een H-index <16 al een afwijking > 14,2% vertoont, heeft de vanadaatmethode tot een H-index van 460 < 14,2% interferentie door hemolyse. Dit zou leiden tot een minimale afkapgrens voor betrouwbare rapportage van H.I. = 460.

Deze afkapgrens van H.I. = 460 blijkt echter niet haalbaar voor alle concentraties van bilirubine. Figuur 1 toont een hoge variatie in de resultaten van het onderzoek naar de afkapgrens voor de H.I. Deze variatie blijkt te correleren met de directe bilirubine concentratie in het monster. De interferentie van hemolyse op de bilirubine concentratie wordt procentueel sterker bij hogere concentraties bilirubine in de vanadaatmethode. De procentuele interferentie voor de diazomethode wordt echter minder sterk bij hogere concentraties bilirubine (Figuur 1B, C, D). De meest veilige afkapgrens voor de vanadaatmethode zou gebaseerd moeten worden op de resultaten van de hoge concentraties direct bilirubine (Figuur 1D). De zo gevonden afkapgrens wordt dan H.I. = 235.

Interferentie lipemie

In tegenstelling tot wat aangegeven werd door de fabrikant blijkt de vanadaatmethode gevoelig voor interferentie van lipemie. Deze interferentie is sterker dan bij de diazomethode (Figuur 2). Op basis van de gekozen afkapgrens van 14,2% als maximale acceptabele bias door interferentie werden de volgende afkapgrenzen voor betrouwbaarheid bij lipemie gevonden: een L.I. >400 voor de diazomethode en L.I. = 122 voor de vanadaatmethode. 

Verificatie juistheid en reproduceerbaarheid

Ter verificatie van de bruikbaarheid van reagens voor direct bilirubine gebaseerd op een vanadaatmethode, werd dit reagens vergeleken met de huidige diazo methode. Precisie van beide methoden waren vergelijkbaar: 2,5% en 1,5% vs. 1,9% en 1,8% voor respectievelijk de diazo methode en de vanadaatmethode op een controleniveau van 18,6 en 49,2 µmol/L. Patiëntvergelijk in lithium-heparine plasma van volwassenen zonder hemolyse (n=40) vertoont een acceptabele bias voor de vanadaatmethode ten opzichte van de diazomethode (-12%) (Figuur 3).

Verificatie voor gebruik voor neonaten

Omdat met name voor neonaten met de huidige methode veel bepalingen afgekeurd worden (>50%), is eenzelfde vergelijk zoals hierboven beschreven uitgevoerd met lithium heparine plasma van neonaten (kinderen < 3 maanden oud). Hier werd een opvallend verschil gezien met de huidige methode. Het vergelijk vertoont een sterke positieve bias ten opzichte van de diazomethode van +69% (n=50). In tegenstelling tot de volwassen monsters, bevat deze data echter monsters met een H.I. >16. Dit geeft volgens de leverancier interferentie >10% door hemolyse in de diazomethode. Exclusie van data met afwijking door hemolyse leidt tot een bias van +50% (n=23) (Figuur 4). Aangezien de data van beide methodes dan echter nog steeds sterk verschillen op basis van mate van interferentie door hemolyse, is besloten alle waarden te corrigeren voor de invloed van hemolyse (gebaseerd op resultaten Figuur 1B-D). Hieruit volgt een resterende bias van +30% van de vanadaatmethode ten opzichte van de diazomethode na controle voor H.I. bij neonaten (Figuur 5). 

Een deel van de initieel gevonden verschillen tussen de bepaling van direct bilirubine voor volwassen en neonaten door de vanadaatmethode en diazomethode kan dus verklaard worden door de gevoeligheid van de beide methodes voor hemolyse. Echter ook na correctie voor interferentie van hemolyse blijft er een opvallend verschil te zien tussen lithium-heparine plasma van volwassen patiënten (negatieve bias) en neonaten (sterk positieve bias).

Discussie

In deze studie zijn twee methoden voor het bepalen van direct bilirubine met elkaar vergeleken. Reden van deze studie was de hoge mate van interferentie van hemolyse met de huidige diazomethode. Wanneer de door de firma geadviseerde afkapgrenzen gehanteerd werden, werd >50% van de bepalingen afgekeurd. In de nieuwe methode wordt bilirubine geoxideerd door middel van vanadaat. Hoewel deze methode gevoeliger is voor interferentie van lipemie, is de invloed van hemolyse lager. (19) Waar de diazomethode >10% afwijkt bij een H.I. van 15.5 µmol /L, wordt deze afwijking in het vanadaat reagens pas gezien bij een H.I. van 250 µmol/L.

Desondanks is er om twee redenen gekozen voor een andere afkapgrens dan 250 µmol/L. Ten eerste is de door de leverancier aangeraden maximale afwijking van 10% een arbitraire grens die voor elke bepaling hetzelfde gesteld is. Als klinisch relevante afkapgrens is hier gekozen voor de maximaal acceptabele bias op basis van de biologische variatie van direct bilirubine (14,2%), zoals vermeld in de ‘Desirable Biological Variation Database’. (18) Ten tweede heeft subgroepering van de resultaten voor de interferentie van hemolyse geleid tot de conclusie dat de procentuele invloed van hemolyse op de bepaling van direct bilirubine afhankelijk is van de concentratie direct bilirubine. De interferentie door hemolyse is voor de vanadaatmethode procentueel sterker bij hogere concentraties bilirubine. Daarom is gekozen om de afkapgrens vast te stellen gebaseerd op de hogere bilirubine concentraties. Hoewel de grens dan relatief laag ligt voor lage concentraties bilirubine, blijven de hoge concentraties bilirubine zo wel betrouwbaar te bepalen. De gekozen maximale afwijking van 14,2% leidt zo tot een afkapgrens van een H.I. = 235 µmol/L.

Het meest opvallende resultaat in deze studie is het verschil tussen de reagentia voor direct bilirubine bij neonaten en volwassenen. Hoewel een deel van de in eerste instantie sterke bias van +50% te verklaren is door de gevoeligheid van de diazomethode voor hemolyse, blijft na normaliseren een bias over van +30%. Ten opzichte van de bias van volwassenen (-10%) is er dus een verschil van +40% tussen volwassenen en neonaten.

Verschillen tussen methodes bij bepaling van bilirubine in plasma van volwassenen en neonaten werden al eerder beschreven voor de bepaling van totaal bilirubine. (20) Een vergelijk tussen twee methodes toonde een bias van +30% voor totaal bilirubine (Modular, Roche ten opzichte van Vitros, Ortho). Materiaal van neonaten daarentegen toonde juist vergelijkbare resultaten. Eerdere studies hebben de oorzaak van de verschillen gevonden in de samenstelling van bilirubinefracties in kalibratoren. (21) Doordat de te meten stof (totaal bilirubine) niet duidelijk gedefinieerd is, de matrix een variatie aan fracties kan bevatten en er verschillende methodes op de markt zijn is de standaardisatie van totaal bilirubine complex gebleken. (22)

Hetzelfde lijkt te gelden voor de direct bilirubine bepaling. Bilirubine is met HPLC te onderscheiden in vier verschillende fracties (α, β, γ, δ). Direct bilirubine wordt echter gedefinieerd als de som van de chemisch reagerende fracties. Hoewel in alle reagentia de β en γ fractie in grote mate bepaald worden, lijkt met name het reageren van de δ fractie en enige kruisreactiviteit met het ongeconjugeerde bilirubine (α-fractie), voor variatie te zorgen. Juist in deze δ fractie zit een groot verschil tussen neonaten en volwassenen. De verklaring voor de gevonden verschillen ligt dan dus ook meest waarschijnlijk in de mate van reageren van deze δ-fractie (Figuur 6). Voor de diazomethode is bekend dat zowel de β, γ, als δ fractie reageren, maar ook dat deze niet volledig reageren. (23) Voor oxidatieve methodes (zoals de hier gebruikte vanadaatmethode) is bekend dat met name de β en γ fracties reageren, het aandeel van δ-fractie is echter zeer afhankelijk van pH, van het type-, en van de concentratie van de oxiderende stof. (24) Daarnaast zouden, evenals in de totaal bilirubine bepaling, verschillen in matrix of samenstelling van bilirubinefracties in de gebruikte kalibratoren de uitslagen kunnen beïnvloeden. (25)

In overleg met neonatologen van het kinderziekenhuis werd de voorkeur gegeven aan de nieuwe vanadaatmethode. Belangrijkste reden was de sterk verlaagde interferentie door hemolyse. Omdat de diagnose cholestase bij neonaten niet alleen op direct bilirubine gebaseerd wordt, is besloten de bias ten opzichte van de eerdere methode daarbij te accepteren voor neonaten. Omdat de problemen met hemolyse met name voorkomen bij moeilijke afnames bij kinderen, is besloten de vanadaatmethode alleen in gebruik te nemen bij kinderen < 3 jaar. Op basis van de maximale bias voor interferentie van 14,2%, is de afkapgrens voor hemolyse bij de vanadaatmethode voor direct bilirubine gesteld op een H.I. van 235. Dit heeft in ons kinderziekenhuis in het afgelopen jaar geleid tot een sterke vermindering van afgekeurde bepalingen van direct bilirubine door hemolyse bij kinderen < 3 jaar (Tabel 2). 

In deze studie is een vanadaatmethode geverifieerd voor de bepaling van direct bilirubine. Deze ondervindt duidelijk minder invloed van hemolyse dan de diazomethode. De verificatie toont het belang aan van een juiste representatie van de doel-populatie (i.e. neonaten) in een patiëntvergelijk. In dit geval bleken verschillen aanwezig tussen bepalingen voor direct bilirubine bij volwassen en neonaten. Hoewel de oorzaak zeer waarschijnlijk ligt in de mate van reactie met de diverse bilirubinefracties, is de exacte oorzaak nog onduidelijk. Meer onderzoek naar de oorzaak van deze verschillen, gevolgd door standaardisatie van de bepaling van direct bilirubine, is nodig om vergelijkbare diagnostiek en afkapgrenzen tussen laboratoria en reagentia te kunnen garanderen.

Summary

The current test for direct bilirubin, based on the Jendrassik-Grof method, is sensitive for interference by hemolysis. The aim of this study is to investigate whether the measurement of direct bilirubin with a vanadate reagent can be used as a reliable and useful alternative.

Patient material was spiked with an increasing concentration of hemolytic and lipemic material and direct bilirubin was measured with both reagents. In addition, a comparison of patient material was performed in lithium heparin plasma for both adults and neonates.

The vanadate method is less sensitive to hemolysis interference compared to the diazo method (cutoff hemolytic index = 235 vs. 16, respectively). Comparison of the two methods shows a bias of -10% for the vanadate method compared to the diazo method. The comparison for neonates, however, shows a bias of + 30%.

This study shows that the vanadate method is a useful alternative for the diazo method. Furthermore, differences were observed between measurements for direct bilirubin in adults and neonates. This is most likely caused by a variation in reacting bilirubin fractions and the differences in fractions between adults and neonates.