Samenvatting
Volgens de richtlijn ‘Preanalytische voorschriften voor de stollingsbepalingen, 2016’ dienen bloedafnamebuizen voor stollingsbepalingen verticaal te worden getransporteerd. Verticaal transport heeft enkele nadelen. Benodigde buizenrekken maken transportkoffers zwaar en inefficiënt in gebruik. Bulkladers, onderdeel van total lab automation-oplossingen, kunnen niet worden gebruikt omdat bloedafnamebuizen daarin tot aan één uur horizontaal liggen. Vanwege beperkte bewijslast voor de noodzaak van verticaal transport is in deze studie het effect van buisoriëntatie op stabiliteit van volbloedmonsters tijdens transport nogmaals onderzocht. Transportcondities zijn nagebootst door bloedafnamebuizen (buisvolume: 1 en 3 ml) verticaal en horizontaal te schudden voor 6 en 12 uur. Na centrifugeren zijn stollingsbepalingen (APTT, PT, INR, D-dimeer, fibrinogeen en antitrombine) gemeten op een Sta-R Max. Resultaten zijn weergegeven als relatieve veranderingen ten opzichte van controlebuizen (t = 0 uur). Bij een maximale tijd tussen bloedafname en centrifugeren van 6 uur kunnen bloedafnamebuizen met een volume van 1 en 3 ml horizontaal worden getransporteerd.
Summary
According to guideline ‘Preanalytical requirements for coagulation tests, 2016’ vertical transportation of blood collection tubes for coagulation tests is needed. Vertical transportation has some disadvantages. Required tube racks make transport cases heavy and inefficient to use. Bulk loaders, part of total lab automation solutions, cannot be used because tubes have horizontal orientations for up to one hour. Due to limited proof for the need of vertical transportation, this study re-examined effects of tube orientation on stability of whole blood samples during transportation. Transportation conditions were simulated by shaking tubes (tube volume: 1 and 3 ml) in vertical and horizontal positions for 6 and 12 hours. After centrifugation coagulation tests (APTT, PT, INR, D-dimer, fibrinogen and antithrombin) were measured on a Sta-R Max. Results are shown as relative changes compared to control tubes (t = 0 hours). Horizontal transportation of 1 and 3 ml tubes is feasible when applying a maximum time of 6 hours between blood collection and centrifugation.
Inleiding
Het merendeel van de laboratoriumfouten vindt plaats in de preanalytische fase (1,2). Omdat afwijkingen in deze fase een significant effect kunnen hebben op laboratoriumuitslagen, zoals bijvoorbeeld bij stollingsbepalingen (3), is het noodzakelijk om voorgedefinieerde preanalytische condities vast te stellen om integriteit van bloedmonsters te garanderen (4). Deze preanalytische criteria, waaronder de methode van uitvoering van de bloedafname (5), de te gebruiken bloedafnamebuizen, antistollingsmiddelen en bijbehorende concentraties, buisvulling, centrifugatie-protocollen en transport van bloedafnamebuizen naar het laboratorium (6) worden beschreven in diverse (inter)nationale richtlijnen en aanbevelingen. Voor stollingsbepalingen gelden specifieke preanalytische condities voor het transport van bloedafnamebuizen, waaronder de oriëntatie van bloedafnamebuizen tijdens het transport (6), en de tijd tussen bloedafname en analyse (7). Volgens de richtlijn ‘Preanalytische voorschriften voor de stollingsbepalingen: PT, PT-INR, aPTT, fibrinogeen, FV, FVIII, antitrombine, D-dimeer en lupus anticoagulans, 2016’ van Stichting Kwaliteitsbevordering Stollingsonderzoek, is het een vereiste om bloedafnamebuizen voor stollingsbepalingen verticaal (staand) te transporteren (6). Dit geldt voor het gehele preanalytische traject vanaf direct na bloedafname tot aan het moment dat bloedafnamebuizen ter analyse worden aangeboden. Praktische nadelen hiervan zijn echter de beperking van het gebruik van bulkladers bij labstraten, waarbij bloedafnamebuizen niet rechtop staan, en het efficiënt gebruik van transportkoffers vanwege de extra benodigde ruimte voor buizenrekken om bloedafnamebuizen rechtop te transporteren.
De noodzaak voor het verticaal transporteren van bloedafnamebuizen is gebaseerd op slechts één studie (8). Hierin wordt beschreven dat verticaal transport resulteert in minder stimulatie van coagulatie dan tijdens horizontaal (liggend) transport van bloedafnamebuizen, waardoor minder hemolyse en bloedplaatjes- en factoractivering plaatsvindt. Stollingsactivatie dient zoveel mogelijk beperkt te worden omdat stollingsactivatie kan resulteren in kortere stollingstijden in vitro (9). Een nadeel van deze studie is echter dat conclusies zijn gebaseerd op een ongepaarde vergelijking tussen horizontaal en verticaal geschudde bloedafnamebuizen middels verschillende agitatieprotocollen (schudden en roteren), waarbij een directe vergelijking ontbreekt. Daarnaast is er geen gedetailleerde informatie inzichtelijk over gebruikte agitatieprotocollen en worden bloedafnamebuizen continu gestimuleerd tijdens het experiment, wat niet de huidige praktijk is tijdens transport. Bijvoorbeeld, het roteren van bloedafnamebuizen met een snelheid van één rotatie per seconde resulteert na 6 uur in 21.600 omwentelingen. De wetenschappelijke onderbouwing voor de noodzaak van verticaal transport van bloedafnamebuizen voor stollingsbepalingen lijkt hierdoor beperkt.
Het effect van oriëntatie van de bloedafnamebuizen op stollingsbepalingen is in de huidige studie onderzocht door bloedafnamebuizen (horizontaal en verticaal), met verschillende buisvulling (1 en 3 ml) en tijd tussen bloedafname en centrifugeren (0, 6 en 12 uur), mechanisch te stimuleren middels een model dat transport nabootst. De tijd tussen bloedafname en centrifugeren van 6 uur is representatief voor bloedafnamebuizen afkomstig uit de eerste lijn en is in Rijnstate voor diverse stollingsbepalingen gevalideerd en wordt beschreven in literatuur (3,6). Tevens wordt voor sommige stollingsbepalingen een langere tijd tussen bloedafname en centrifugeren beschreven (6), daarom is additioneel de tijd tussen bloedafname en centrifugeren van 12 uur onderzocht. Effecten van preanalytische variabelen op de stabiliteit van volbloedmonsters zijn onderzocht voor diverse stollingsbepalingen: geactiveerde partiële tromboplastinetijd (APTT), protrombinetijd (PT), international normalized ratio (INR), D-dimeer, fibrinogeen en antitrombine III (AT-III).
Methode
Tijdens reguliere bloedafname is bij tachtig patiënten in Rijnstate na het ondertekenen van informed consent extra bloed afgenomen. Bij elke patiënt zijn in totaal drie extra natriumcitraatbuizen (Greiner Bio-One, Kremsmünster, Oostenrijk) afgenomen met identieke buisvulling (1 ml volbloed: 9NC, natriumcitraat 3,2%, REF 454320; 3 ml volbloed: 9NC, natriumcitraat 3,2%, REF 454334). De patiënten zijn geanonimiseerd en verdeeld over vier experimenten (n = 20 per experiment), waarbij 1 of 3 ml bloedafnamebuizen (met identieke buisafmetingen) zijn afgenomen. Een andere variabele is de tijd tussen bloedafname en centrifugeren (6 of 12 uur).
Het schudden van bloedafnamebuizen tijdens transport was nagebootst met behulp van een schudapparaat (Labnet Nutating mixer, Labnet International, Inc., Edison, NJ, VS) waarop een kartonnen bak, vergelijkbaar in grootte met een transportkoffer, is bevestigd (figuur 1). Doordat bloedafnamebuizen tegelijk in de bak konden worden gelegd en aan de bak worden bevestigd werden respectievelijk horizontaal en verticaal transport in een gepaarde meting nagebootst. In de bak konden bloedafnamebuizen over een afstand van ongeveer 20 cm van links naar rechts bewegen. Het schudapparaat was 15 min/uur voor de duur van het experiment (6 of 12 uur) continu geactiveerd met een snelheid van 20 RPM (supplement 1: film model mechanische stimulatie bloedafnamebuizen).
Bloedafnamebuizen zijn na 6 en 12 uur gecentrifugeerd (Hettich Rotina 380, Rotine 46RS, Tuttlingen, Duitsland; 6 min, 3000 g) om plasma te verkrijgen zonder bloedplaatjes en cellen. De controlebuis (t = 0) is direct na bloedafname gecentrifugeerd en geanalyseerd.
Stollingsbepalingen zijn uitgevoerd op een Sta-R Max (Diagnostica Stago, Parijs, Frankrijk) met de volgende reagentia: geactiveerde partiële tromboplastinetijd (APTT; STA® - Cephascreen®, Stago), protrombinetijd (PT; STA® - Neoplastine®, Stago), international normalized ratio (INR; STA® - Hepato-Prest, Stago), D-dimeer (STA® - Liatest® D-Di PLUS, Stago), fibrinogeen (STA® - Liquid Fib, Stago) en antitrombine III (AT-III; STA® - Stachrom® AT III, Stago).
Resultaten zijn per tijdspunt uitgedrukt als de relatieve verandering (RV) ten opzichte van t = 0 (controlebuis). De RV is beoordeeld ten opzichte van toegepaste criteria door Geest-Daarderop et al., 1) gemiddelde RV <10% (8) en 2) aantal individuele metingen met een RV >10% moet kleiner moet zijn dan 25 procent van het totaal aantal metingen (n = 20 per experiment; ≤4 metingen) (3,8), en 3) gemiddelde RV < total change limit (TCL; √((0.77CVa)²+(0.5CVb)²)) (4). De TCL is een klinisch relevant criterium gebaseerd op de analytische CV (CVa, vastgesteld op QC data, zie supplement 2) en de biologische variatie (CVb, zie supplement 2) (10,11). Significante verschillen zijn geanalyseerd in GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., version 5, La Jolla, CA, Verenigde Staten) middels gepaarde t-toetsen. Hierbij zijn p-waarden <0,05 als statistisch significant beschouwd.
Resultaten
Buisvulling 3 ml - 6 uur schudden
Bij alle stollingsbepalingen was de gemiddelde relatieve verandering (RV) op t = 6 uur ten opzichte van de controle buis (t = 0 uur) voor horizontaal (liggend) en verticaal (staand) geschudde bloedafnamebuizen kleiner dan de gestelde TCL- en RV<10%-criteria (figuur 2). Ook alle individuele APTT, PT, INR, fibrinogeen en AT-III waarden overschreden deze criteria niet. Voor D-dimeer werden de TCL- en RV<10%-criteria overschreden door respectievelijk 2 of >4 resultaten, voor zowel horizontaal als verticaal geschudde bloedafnamebuizen, zonder significante verschillen tussen beide groepen. Ondanks significante verschillen, op basis van gepaarde t-toetsen, bij de APTT, INR en PT tussen horizontaal en verticaal geschudde bloedafnamebuizen werd wel voldaan aan het RV<10%-criterium en klinisch relevante TCL-criterium.
Buisvulling 1 ml - 6 uur schudden
Voor zowel horizontaal als verticaal geschudde buizen werden geen RV<10%- en TCL-criteria overschreden door de gemiddelde RV bij de verschillende stollingsbepalingen (figuur 3). Indien enkele resultaten de gestelde criteria overschreden betrof dit <25% van het totaal aantal metingen. Bij de APTT, AT-III, fibrinogeen en D-dimeer zijn geen significante verschillen aanwezig tussen horizontaal en verticaal geschudde buizen, wel voor de INR en PT. Indien een maximale tijd tussen bloedafname en centrifugeren van 6 uur wordt aangehouden volstaat zowel horizontaal als verticaal transport van bloedafnamebuizen met een buisvulling van 1 ml.
Buisvulling 1 en 3 ml - 12 uur schudden
Om de marge van tijd tussen bloedafname en analyse in extremere mate te onderzoeken is gekozen voor een tijdspunt van 12 uur tussen bloedafname en analyse. Na 12 uur was bij alle stollingsbepalingen voor zowel horizontaal als verticaal geschudde bloedafnamebuizen, de gemiddelde RV kleiner dan de gestelde TCL- en RV<10%-criteria (figuur 4). Alle INR en fibrinogeen resultaten hadden een RV kleiner dan de gestelde TCL- en RV<10%-criteria. Bij de PT werd bij verticaal geschudde bloedafnamebuizen door enkele resultaten het TCL-criterium overschreden, maar niet het RV<10%-criterium. Door het brede TCL-criterium van AT-III zijn er enkele resultaten die alleen het RV<10%-criterium overschrijden. Bij de APTT en D-dimeer overschrijden meerdere resultaten zowel de gestelde RV<10%- en TCL-criteria, zonder significante verschillen tussen horizontaal en verticaal geschudde bloedafnamebuizen. Er waren alleen significante verschillen tussen horizontaal en verticaal geschudde bloedafnamebuizen bij de INR en PT, waarbij de RV voor horizontaal geschudde bloedafnamebuizen kleiner was dan voor verticaal geschudde buizen.
Bij bloedafnamebuizen met een buisvulling van 1 ml lijkt er een trend aanwezig te zijn dat verticaal transport de voorkeur heeft boven horizontaal transport (figuur 5). Bij buizen horizontaal geschud voor 12 uur werden TCL- en RV<10%-criteria overschreden door de gemiddelde RV bij de APTT en PT, terwijl bij verticaal geschudde buizen gestelde criteria niet werden overschreden. Voor meerdere stollingsbepalingen is de tijd tussen bloedafname en centrifugeren van 12 uur niet geschikt bij bloedafnamebuizen met een buisvulling van 1 ml.
Discussie
In deze studie is aangetoond dat bloedafnamebuizen horizontaal (liggend) kunnen worden getransporteerd naar het laboratorium, zonder dat dit relevante effecten heeft op de houdbaarheid van resultaten voor diverse stollingsbepalingen, indien bloedafnamebuizen binnen 6 uur worden gecentrifugeerd. De mogelijkheid voor horizontaal transport van bloedafnamebuizen is momenteel beperkt door een aanbeveling in de richtlijn ‘Preanalytische voorschriften voor de stollingsbepalingen: PT, PT-INR, aPTT, fibrinogeen, FV, FVIII, antitrombine, D-dimeer en lupus anticoagulans, 2016’ van Stichting Kwaliteitsbevordering (6). Hierin wordt verticaal (staand) transport verplicht met als wetenschappelijke onderbouwing een studie van Van Geest-Daalderop et al. (8).
Dat uit onze studie blijkt dat bloedafnamebuizen wel horizontaal kunnen worden getransporteerd, komt mogelijk door de keuze van de experimentele benadering. Naast het vergelijken van buisoriëntaties (horizontaal en verticaal) is tevens rekening gehouden met additionele preanalytische factoren, zoals buisvulling en transporttijden naar het laboratorium, alsmede het gebruik van gepaarde metingen (directe vergelijkingen tussen staande en liggende buizen blootgesteld aan dezelfde agitatiecondities) en het toepassen van klinisch relevante criteria ter beoordeling van de resultaten. Een beperking van de studie van Van Geest-Daalderop et al. (8) is het ontbreken van deze gepaarde vergelijkingen tussen buisoriëntaties, enerzijds door het gebruiken van verschillende agitatieprotocollen (schudden en roteren) en anderzijds door het toepassen van deze agitatieprotocollen in verschillende laboratoria. Ook zijn er geen additionele preanalytische factoren onderzocht, zoals de buisvulling en maximale tijd tot preanalyse. In onze studie is aangetoond dat deze preanalytische factoren ook een significante impact hebben op de houdbaarheid van bloedmonsters en het accepteren van bepaalde preanalytische condities. Zo blijkt dat 1 en 3 ml bloedafnamebuizen zowel horizontaal als verticaal kunnen worden getransporteerd bij een maximale tijd tot preanalyse van 6 uur. De toegepaste criteria in deze studie voor het beoordelen van de resultaten zijn afgeleid van eerder gehanteerde criteria door Van Geest-Daalderop et al. (8) en klinisch relevante criteria elders beschreven (4). De t-test en relatieve verandering <10%, zoals gebruikt in de studie van Van Geest-Daalderop et al. (8), zijn beperkt toepasbaar in de klinische praktijk en arbitrair. Daarom is er in deze studie aanvullend gekozen voor het gebruik van de totale wijzigingslimiet (total change limit; TCL), welke is opgebouwd uit de analytische en intra-individuele imprecisie. Hierdoor kunnen enkele significante verschillen op basis van gepaarde t-toetsen tussen horizontaal en verticaal geschudde bloedafnamebuizen toch worden geaccepteerd doordat wel werd voldaan aan het klinisch relevantere TCL-criterium. Indien voor horizontaal en verticaal geschudde bloedafnamebuizen alle criteria werden overschreven, zoals voor D-dimeer in figuur 1, betrof dit metingen van dezelfde patiënten zonder significante verschillen tussen beide transportcondities.
De maximale tijd tussen bloedafname en centrifugeren bij stollingsonderzoek wordt in meerdere richtlijnen beschreven, zoals de ‘Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) richtlijn H21-A5’ (7) en ‘Preanalytische voorschriften voor de stollingsbepalingen: PT, PT-INR, aPTT, fibrinogeen, FV, FVIII, antitrombine, D-dimeer en lupus anticoagulans, 2016’ (6). In deze richtlijnen staat beschreven, bijvoorbeeld voor de APTT, dat volbloedmonsters slechts 4 uur houdbaar zijn bij kamertemperatuur. In diverse studies, net als in onze studie, is aangetoond dat de maximale tijd tussen bloedafname en centrifugeren voor deze stollingsbepalingen minimaal kan worden verlengd tot 6 uur (3,6).
Middels een model is in deze studie het transport van bloedafnamebuizen naar het laboratorium nagebootst. Een mogelijke beperking van het model is de tijd dat het schudapparaat was geactiveerd. Omdat bloedafnamebuizen in de praktijk mogelijk minder worden blootgesteld aan agitatie dan in deze studie is toegepast zullen relatieve veranderingen na 6 uur in werkelijkheid mogelijk kleiner zijn. Daarnaast kan het verschil in compliantie tussen de kartonnen bak, waar de bloedafnamebuizen in waren gelegd of bevestigd, en de wand van de transportkoffers, effect hebben op de resultaten. Het is echter aannemelijk dat de binnenbekleding van transportkoffers meer bijdraagt aan demping van agitatie dan de kartonnen bak. In deze studie zijn alle experimenten uitgevoerd met één merk bloedafnamebuizen, één type reagens en één type analyzer. Daarom zijn slechts de mogelijkheden voor verticaal transport van bloedafnamebuizen aangetoond en moeten laboratoria dit met eigen (pre)analytische methoden valideren voordat het geïmplementeerd kan worden.
Conclusie
Bij een maximale tijd tot preanalyse van 6 uur kunnen bloedafnamebuizen met een volume van 1 en 3 ml zowel horizontaal (liggend) als verticaal (staand) worden getransporteerd.