Het probleem
Momenteel zijn er meer dan honderd methoden op de markt beschikbaar voor het meten van HbA1c. De methoden kationuitwisselings-HPLC en capillaire elektroforese kunnen door middel van een chromatogram aantonen of er al dan niet een Hb-variant aanwezig is. De meest voorkomende Hb-varianten (HbAS, HbAC, HbAD, HbAE) interfereren normaal gesproken niet met het meten van HbA1c. Echter sommige zeldzame Hb-varianten hebben dezelfde retentietijd als A0 en laten dan een normaal chromatogram zien, alsof er geen Hb-variant aanwezig is, waardoor mogelijk een vals verlaagd HbA1c-resultaat gerapporteerd wordt.
Onderzoeksvraag
Hoeveel foutieve HbA1c-resultaten rapporteren wij met de Tosoh G8 vanwege de aanwezigheid van een ‘verborgen’ zeldzame Hb-variant in vergelijking met de Sebia Capillarys 3 Tera (Cap3T)? Wij stelden vooraf dat niet meer dan 1 op de 1000 monsters een foutief gerapporteerde HbA1c mag zijn als gevolg van een zeldzame Hb-variant. Dit is een arbitrair gekozen criterium.
Laboratoriumdiagnostiek
In de periode 23 februari tot 17 maart 2020 zijn 3098 monsters geanalyseerd met één van de twee Tosoh G8-systemen aangesloten op een Sysmex XN-9000 automatiseringslijn en op de Cap3T. Figuur 1 laat een schematisch overzicht zien van de studie plus de resultaten. De 3098 gemeten monsters gaven geen vlag met de Tosoh G8. Binnen de Epu-software van de Sysmex XN-9000 zijn verschillende alarmen geïmplementeerd om monsters met een abnormaal chromatogram te markeren voor verdere beoordeling, waaronder de LA1c / SA1c-ratio >0,70 vlag om mogelijke HbAJ-varianten op te pikken [1]. Deze variant geeft een normaal chromatogram maar het HbA1c-resultaat is vals verlaagd. Alle monsters met een vlag worden in ons laboratorium geanalyseerd op de Trinity Biotech Premier Hb9210 boronaataffiniteit HPLC. Deze methode wordt niet beïnvloed door de aanwezigheid van Hb-varianten [2, 3].
Vijfentwintig van de in totaal 3098 gemeten monsters gaven een atypisch profiel op de Cap3T maar geen vlag met de Tosoh G8 in de Sysmex XN-9000 automatiseringslijn. Deze monsters zijn ook gemeten op de Tosoh G8 van het European Reference Laboratory for Glycohemoglobin (ERL) om het chromatogram goed te kunnen bekijken en op de Premier Hb9210 welke in dit onderzoek als referentiemethode diende. Alle chromatogrammen met een atypisch profiel werden beoordeeld door de productmanager van Sebia. De melding van een atypisch profiel is alleen gebaseerd op het aantal pieken (minder of meer dan 4 pieken) samen met de vorm van de pieken (asymmetrisch, schouder op A0- en/of HbA1c-pieken). In sommige gevallen kan de Cap3T een kleine HbF-piek identificeren, die te klein is om te kwantificeren, maar toch de melding van een atypisch profiel zal geven. Eenentwintig van de 25 monsters gaven zowel op de Tosoh G8 als ook op Cap3T een correct HbA1c-resultaat aangezien de resultaten overeen kwamen met de resultaten van de Premier Hb9210 (Total Allowable Error (TAE) was <10%). Een TAE van >10% wordt algemeen gezien als klinisch relevant (2). Achttien van die 21 monsters bleken een kleine HbF-piek te hebben. Twee van de 21 monsters werden beoordeeld als een mogelijke delta-variant en 1 als een mogelijk geval van bèta-thalassemie. Vier van de 25 monsters gaven geen HbA1c-resultaat met de Cap3T vanwege de aanwezigheid van een schouder of een extra piek op HbA0- en/of HbA1c-piek maar gaven wel een resultaat met de Tosoh G8. Drie van die vier monsters werden beoordeeld door de productmanager van Sebia als mogelijke alfa-varianten en één als een mogelijke zeldzame Hb-variant [figuur 2a]. De drie mogelijke alfa-varianten werden niet gedetecteerd door de Tosoh G8 maar deze mogelijke alfa-variant had geen invloed op het HbA1c-resultaat aangezien de resultaten overeen kwamen met de Premier Hb9210.
Het vierde monster werd ook niet opgemerkt door de Tosoh G8. Echter toen het chromatogram manueel werd gecontroleerd, was de A0-piek iets breder dan normaal en was de LA1c-piek onregelmatig [figuur 2b]. De Premier Hb9210 gaf een resultaat van 38.2 mmol /mol en de Tosoh G8 30.5 mmol /mol. Om te controleren of er een zeldzame Hb-variant aanwezig was, werd het monster geanalyseerd op de Sebia Capillarys 2 Flex Piercing, in Hemoglobin-modus. Deze methode wordt speciaal gebruikt voor het detecteren van een groot aantal Hb-varianten en thalassemieën. Het elektroferogram vertoonde geen extra piek, dus hoogstwaarschijnlijk werd de extra piek op de HbA1c-piek [figuur 2a] veroorzaakt door een Hb-variant die met HbAO migreert met de Sebia Capillarys 2 Flex Piercing, in Hemoglobin-modus of er was sprake van een instabiele variant die in de Hb-modus was verdwenen [figuur 2c].
Interpretatie
De Tosoh G8 voldeed aan het vooraf gestelde criterium dat niet meer dan 1 op de 1000 monsters een foutief gerapporteerde HbA1c mag zijn als gevolg van een zeldzame Hb-variant. Op basis van 3098 gemeten monsters op de Tosoh G8 en de Cap3T, werd één mogelijke maar niet bevestigde, zeldzame Hb-variant gevonden. De Cap3T gaf geen HbA1c-resultaat en de Tosoh G8 gaf een vals verlaagd HbA1c-resultaat vergeleken met de Premier Hb9210.
Etnische diversiteit leidt tot een hogere prevalentie van Hb-varianten. De uitkomst van dit onderzoek zou zeer waarschijnlijk anders zijn geweest als het was uitgevoerd in Amsterdam of Rotterdam waar een grotere etnische diversiteit is dan in Zwolle.
De perfecte methode voor HbA1c bestaat niet. Alle methoden hebben hun eigen unieke voor- en nadelen. De Tosoh G8 mist wellicht enkele zeldzame Hb-varianten en rapporteert hierdoor een vals verlaagde HbA1c, maar de Cap3T geeft geen HbA1c-resultaat wanneer de Hb-variant een schouder of extra piek op de HbA0- en/of HbA1c-piek veroorzaakt. Deze monsters moeten met een andere methode worden geanalyseerd of naar een ander laboratorium worden gestuurd wat de efficiëntie van het laboratorium vermindert. Echter het is beter om geen HbA1c -resultaat te rapporteren dan een foutief resultaat