Fosfatidylethanol (PEth) in volbloed als biomarker voor alcohol gebruik

Samenvatting

Dit onderzoek evalueert de prestaties van een LC-MS/MS-methode voor het meten van fosfatidylethanol (PEth) in volbloed als biomarker voor alcoholgebruik. PEth is een fosfolipide dat specifiek wordt gevormd in aanwezigheid van ethanol en ingebed is in celmembranen. Vergeleken met traditionele biomarkers zoals CDT en EtG, toont PEth een hoge sensitiviteit als specificiteit, waardoor het een veelbelovende biomarker is voor verschillende klinische toepassingen. PEth biedt de mogelijkheid om zowel op korte termijn als chronisch alcoholgebruik te detecteren. De beschreven methode toont goede analytische prestaties, stabiliteit, en lage interferentie aan. In het onderzochte cohort van zwangere vrouwen (n=800), rondom de 12^e week van de zwangerschap, wordt een lage prevalentie van alcoholconsumptie gezien. Deze studie illustreert de succesvolle validatie van de LC-MS/MS-analysemethode, hetgeen naar onze mening de basis legt voor de routinematige toepassing van PEth in klinisch chemische laboratoria in Nederland. 

Introductie

Fosfatidylethanol (PEth) is een groep van fosfolipiden die alleen gevormd wordt als er ethanol in het lichaam aanwezig is. Het enzym fosfolipase D zet fosfatidylcholine in aanwezigheid van alcohol om in PEth. Deze PEth-moleculen worden binnen in de celmembraan ingebouwd en kunnen vervolgens in het bloed worden gedetecteerd als biomarkers voor alcoholgebruik (1). Hierbij is er geen interferentie van andere stoffen zoals drugs of voedingssupplementen. Echter, in vivo-hemolyse heeft mogelijk wel invloed op PEth en kan leiden tot een vals verlaagde concentratie (2).

Er zijn verschillende vormen van PEth in het lichaam aanwezig, die worden onderscheiden op basis van de lengte en de verzadigingsgraad van de vetzuurketens van de fosfolipiden. De meest voorkomende vormen van PEth zijn de combinatie van vetzuurketens 16:0/18:1 (POPEth), 16:0/18:2 (PLPEth) en 16:0/18:0 (PSPeth). Hierbij staat 16:0 voor Palmitinezuur, een vetzuur met zestien koolstofatomen en geen onverzadigdheden; 18:0 voor Stearinezuur, 18:1 voor Oliezuur en 18:2 voor Linolzuur. Ook kan de PEth-vorm van andere fosfolipiden worden aangetoond (3).

De concentratie van PEth in de membranen van lichaamscellen hangt af van de hoeveelheid ethanol dat is geconsumeerd en de snelheid waarmee de fosfolipiden in de membranen worden vervangen. Bij regelmatig alcoholgebruik hoopt PEth zich op in de membranen van de cellen (4). Vanwege deze eigenschappen is het mogelijk alcohol gebruik over een periode van 2 tot 4 weken te monitoren. Gedurende een periode van abstinentie van alcohol varieert de halfwaardetijd tussen een mediaan van 3,5 en 9,8 dagen (5-9). Bovendien is aangetoond dat het mogelijk is om een eenmalige inname van alcohol te detecteren met behulp van PEth, vanaf 15 tot 30 minuten na inname (10).

Er zijn verschillende vloeistofchromatografische analysemethoden voor PEth in bloedmonsters, waarbij massaspectrografische dan wel UV detectie wordt toegepast (1, 3, 11). De LC-MS/MS-methode is de meest gevoelige en specifieke methode en wordt daarom voornamelijk gebruikt (1, 3, 11).

Detectie van alcoholgebruik

Bij personen die zich presenteren op de spoedeisende hulp met verdenking van alcohol intoxicatie, wordt de actuele ethanol concentratie in het bloed gemeten. Deze bepaling is in de meeste klinisch chemische laboratoria routinematig aanwezig. Echter, vanwege de snelle klaring uit het bloed, kan ethanol alleen gebruikt worden om recente alcoholinname aan te tonen (12).

Ethanol wordt in de lever omgezet door glucuronosyltransferasen en geconjugeerd tot de metabolieten EthylGlucuronide (ethyl βD-6-glucuronide, EtG) en Ethylsulfaat (EtS). EtG is relatief stabiel en wordt via de urine uitgescheiden (13). EtS wordt vaak in combinatie met EtG genoemd. Het vertoont vergelijkbare vorming, farmacokinetiek en eliminatie als EtG, en kan worden gedetecteerd in dezelfde matrices (9, 12, 14). Normaliter wordt alleen EtG bepaald en wordt EtS gebruikt als controleparameter. Afhankelijk van de ingenomen hoeveelheid alcohol kan EtG tot 90 uur na inname detecteerbaar zijn in bloed en urine, zelfs bij lage niveaus van alcoholconsumptie. EtG wordt gemeten met LC-MS/MS of immunoassay.

De bepaling van CDT (Carbohydrate-Deficient Transferrin) is een veelgebruikte methode om langdurig overmatig alcoholgebruik vast te stellen. Deze methode wordt toegepast bij keuringen voor de rijgeschiktheid bij de verdenking van alcoholmisbruik (15). Transferrine bevat twee N-gebonden oligosaccharide zijketens die eindstandig maximaal 8 siaalzuur residuen kunnen bevatten. In personen die aangegeven hebben niet overmatig alcohol te consumeren is de tetrasialovorm met 75-80% het meest aanwezig. Ethanol beïnvloed op een complexe wijze verschillende enzymen die betrokken zijn bij conjugatie van deze siaalzuur residuen en leidt tot een afname van het aantal siaalzuur residuen op transferrine. De mate van alcoholconsumptie blijkt het beste te correleren met de disialotransferrine-isovorm van CDT. Een hogere verhouding van CDT tot totaal transferrine in het bloed wijst op een verhoogd alcoholgebruik in de afgelopen weken tot maanden. Het CDT-niveau kan beïnvloed worden door verschillende factoren, zoals medicatie, leverziekte en genetische variaties in transferrine (12). Ondanks de bestaande internationale standaardisatie van CDT (IFCC-CDT) vertonen sommige methoden afwijkingen die de onderlinge vergelijkbaarheid van resultaten bemoeilijken (16). Vergelijkende studies tussen CDT en PEth, bij personen met overmatig alcohol gebruik en patiënten die een levertransplantatie hebben ondergaan, laten zien dat PEth sensitiever en specifieker is dan CDT (tabel 1) (17-19).

Andere traditionele biomarkers die gebruikt worden om alcohol gebruik te monitoren zijn ALAT, ASAT, ᵧ-GT en MCV. Vanwege hun lage sensitiviteit en specificiteit wordt het gebruik van ALAT, ASAT en MCV afgeraden voor langdurige monitoring van alcoholgebruik (15). Echter, de richtlijn Alcoholmisbruik in het kader van rijgeschiktheidskeuringen geeft aan dat een verhoogde ᵧ-GT-uitslag, mits andere oorzaken zijn uitgesloten, als aanwijzing kan dienen voor alcoholmisbruik (15).

Verschillende studies hebben de sensitiviteit en specificiteit van PEth vergeleken met andere biomarkers voor langdurig alcohol gebruik (13, 14, 17, 18, 20). Deze staan weergeven in tabel 1 (12), hieruit blijkt dat zowel PEth als EtG een hoge sensitiviteit als specificiteit hebben.

Ondanks de beschikbare informatie wordt PEth in Nederland, in tegenstelling tot andere landen, beperkt gebruikt voor de diagnostiek van alcoholgebruik. Veel genoemde redenen zijn de complexe analysemethode maar ook uitdagingen bij standaardisatie. In dit verband is het van belang te vermelden dat er recent een internationale consensus gepubliceerd is met betrekking tot de afkapwaarden voor geheelonthouding, en alcohol consumptie voor PEth (21).

Het ontbreken van standaardisatie, gecertificeerd referentiemateriaal en consensus over het afkappunt is een analytisch nadeel van PEth dat veelvuldig wordt aangehaald. Formeel gezien zou standaardisatie geen probleem mogen zijn omdat de structuur van PEth species volledig bekend is en internationale rondzendingen beschikbaar zijn.

Op grond van genoemde aspecten moet meerwaarde gezien worden voor het gebruik van PEth, aangezien deze methode zowel de eigenschappen van EtG voor korte termijn alcoholgebruik als CDT voor chronisch overmatig gebruik kan combineren. Met dit artikel willen wij de laboratoria wijzen op deze interessante mogelijkheid (14, 22). Als voorbeeld van de toepassing van PEth presenteren wij een studie bij 800 vrouwen, rondom de 12^e week van de zwangerschap, waarvoor wij een LC-MS/MS-methode ontwikkeld hebben.

Methode

Chemicaliën en materialen

De volgende referentiematerialen, namelijk POPEth-16:0/18:1, d5-POPEth-16:0/18:1, PLPEth-16:0/18:2, d5-PLPEth-16:0/18:2, DOPEth-18:1/18:1 en SLPEth-18:0/18:2, zijn verkregen van Echelon Biosciences. LCMS-graad chemicaliën zoals methanol, isopropylalcohol en water zijn aangeschaft bij Biosolve, terwijl ammoniumformaat geleverd is door Sigma-Aldrich. De Eppendorf-cups en reageerbuizen zijn verkregen van VWR, en de autosampler vials van 1,5 mL met 8mm schroefdraad en de 200 µL glazen inserts zijn aangeschaft bij Phenomenex.

Monsterbereiding

De totale lipide-extractie werd uitgevoerd zoals volgt beschreven: 50 µL bloed werd gepipetteerd in een Eppendorf-cup. Daaraan werd 200 µL precipitant met interne standaard (isopropylalcohol met d5-POPEth (350 ng/mL) en d5-PLPEth (225 ng/mL)) toegevoegd. Na menging op een vortex werd het mengsel gecentrifugeerd gedurende 5 minuten bij 10900 rpm bij 20°C. Daarna werd 150 µL supernatant overgebracht naar een autosampler vial.

Standaarden en kwaliteitscontrolemonsters

De PEth-standaarden werden opgelost in een oplossing van 50:50 H2O:MeOH. Uit deze oplossing werd een kalibratiereeks in volbloed bereid (zie tabel 2).

De interne controles (zie tabel 3) zijn in volbloed gemaakt uit een andere batch van standaarden.

Chromatografie

De scheiding van de verschillende PEth-componenten is uitgevoerd op een Shimadzu Nexera LC-40 systeem. Hiervoor is een Phenomenex Luna Omega 1,6µm Polar C18 100Å 150x2,1mm kolom gebruikt bij een temperatuur van 60°C met een looptijd van 3,5 minuten. Mobiele fase A is een mengsel van 10% isopropanol (IPA), 60% acetonitril (ACN), 30% water (H2O) met 0,5 mM ammoniumformaat en mobiele fase B is een mengsel van 79% IPA, 20% ACN, 1% H2O met 0,5 mM ammoniumformaat. De volgende gradiënt is gebruikt, 0 min een flow van 0,45 mL/min en 100% mobiele fase A. Op 0,15 min flow naar 0,50 mL/min en mobiele fase B naar 25%. Op 1,70 min de flow naar 0,45 mL/min en 60% mobiele fase B, op 1,71 min de flow naar 0,80 mL/min en 100% mobiele fase B, op 2,01 min van 100% B naar 100% A. Vervolgens equilibratie met 100% mobiele fase A tot 3,30 min met flow 0,45 mL/min. Het injectievolume is 5 µL.

Massaspectrometrie

De massaspectrometrie van de PEth-componenten is uitgevoerd met electrospray tandem MSMS (ESI-MSMS) op een Shimadzu LCMS-8060. De MS-analyses is uitgevoerd in de negatieve ion modus met multiple reaction monitoring (MRM). De volgende parameters zijn gebruikt: capillaire voltage 3,7 kV, bron temperatuur 400 ° en temperatuur desolvation line (DL) 200 °C. De volgende transities (tabel 4) en additionele parameters zijn gebruikt.

Methode validatie

Tijdens de validatie werden meerdere aspecten beoordeeld. De herhaalbaarheid werd bepaald met de 3 in enkelvoud opgewerkte controlematerialen in duplo te analyseren gedurende 5 dagen en de reproduceerbaarheid door deze controles in zesvoud op te werken en in duplo te analyseren binnen een serie. Het lineaire meetbereik werd vastgesteld door vanuit een buiten het bereik liggende standaard van de PEth-species een verdunningsreeks te maken tot beneden het meetbereik.

De limit of detection (LOD) is bepaald door drie keer de amplitude te nemen van de ruis van zes blanco monsters. Voor de bepaling van de juistheid is voor POPEth externe kwaliteitscontroles (Equalis) in viervoud bepaald.

Er is tevens onderzocht of lipemie interferentie veroorzaakt bij de analyse door toenemende percentages intralipid 20% aan de monsters toe te voegen.

De stabiliteit van calibratoren, controles en oplossingen is vastgesteld door deze te bewaren bij -20 °C en op dag 0, 2, 4, 7 en 10 te analyseren.

Acceptatiecriteria

De acceptatiecriteria voor precisie, reproduceerbaarheid, juistheid en de LOD zijn beschreven in de consensus paper (21). De stabiliteit en interferentie zijn gebaseerd op de criteria beschreven in het artikel van van der Nagel et al. (3).

Patiëntenmonsters

De monsters gebruikt in dit onderzoek, dat door de METC is goedgekeurd, zijn afkomstig van zwangere vrouwen die bloedonderzoek hebben ondergaan als onderdeel van de standaard screening in het eerste trimester van hun zwangerschap. De deelnemende vrouwen werden geïnformeerd via het labformulier in de wachtkamer. Er werd hen de mogelijkheid geboden om het gebruik van restmateriaal te weigeren (opt-out). Vrouwen die zich hiervoor afmeldden, werden uitgesloten van deelname aan het onderzoek. Het bloed werd in EDTA-buizen afgenomen. Na aankomst in het laboratorium werd de standaard screening uitgevoerd en is het restmateriaal verdeeld in 3 porties. Het materiaal is maximaal 18 maanden bewaard tot analyse bij een temperatuur van -80 °C om de stabiliteit voor een langere termijn te borgen (3).

Data-analyse

Voor het integreren en kwantificeren van de chromatogrammen is Labsolutions insight (Shimadzu) gebruikt. De validatieberekeningen en toetsing aan de gestelde criteria zijn uitgevoerd met de Excel applicatie Analyse-it.

Resultaten

Precisie, reproduceerbaarheid en Juistheid

De herhaalbaarheid binnen de drie controlemonsters was ≤9% (zie tabel 5), evenals de reproduceerbaarheid. Voor de juistheid zijn er Equalis monsters voor de POPEth geanalyseerd. Hierbij is er een afwijking van ±10% geconstateerd ten opzichte van de consensuswaarde, deze waarde valt binnen de acceptatie criteria die beschreven zijn in de consensus paper (21). Ter verificatie van de verkregen juistheidsresultaten is een vergelijking met 10 patiëntmonsters uitgevoerd met een extern laboratorium. Voor POPEth was de passing-bablok-vergelijking (y=-2,73 + 1,38 x). Het 95% betrouwbaarheidsinterval is 95%-BI:-8,86-8,11. Voor PLPEth is de passing-bablok-vergelijking is (y=-6,11 + 0,96 x) en 95%-BI:-2,87-14,48 (data niet getoond). De twee methoden leveren vergelijkbare resultaten op confidence interval.

Lineariteit, LOD

Het lineaire meetbereik en LOD zijn weergegeven in Tabel 6. De LoD werd vastgesteld voor elk van de vier PEth-vormen. Deze waarden zijn voldoende om de aan of afwezigheid van PEth te kunnen detecteren, gebruik makend van het afkappunt van <20 ng/ml zoals beschreven in de consensus paper (21).

Stabiliteit

Alle analyten waren stabiel voor 30 dagen bij -20° met een gemiddelde afname van 1,3 % hetgeen voldoet aan de gestelde criteria (<15%).

Interferentie

De interferentie van de additie met Intralipid 20% tot een maximaal percentage van 10% gaf een effect voor alle PEth-vormen van minder dan 10%.

Onderzoek bij zwangere

In een cohort van 800 zwangere vrouwen is in de 12^e week van de zwangerschap de concentratie van PEth in het bloed bepaald, zoals hierboven beschreven. De resultaten werden geclassificeerd volgens de richtlijnen uiteengezet in de consensuspaper van Luginbühl et al. (21). In 98,87% van de zwangere was er geen PEth aantoonbaar; 0,88% was licht positief (5-15 ng/mL) en 0,25% was positief (50-300 ng/mL). Figuur 1 toont een voorbeeld chromatogram van een positief monster.

Discussie

Dit onderzoek heeft de prestatiekenmerken van onze methode voor het bepalen van PEth in volbloed geëvalueerd. De ontwikkelde methode vertoont goede analytische prestaties voor het detecteren van alcoholgebruik, in lijn met eerder gepubliceerde methoden (3, 21). Onze studie bevestigt dat de analyse van PEth-species in volbloed met LC-MS/MS adequaat gemeten kan worden, hoewel deze lipofiele componenten zeker meerdere uitdagingen met zich meebrengen voor een robuuste bepaling.

De vastgestelde prevalentie van alcoholconsumptie (1,25 %) in het onderzochte cohort van zwangere vrouwen is lager in vergelijking met andere publicaties over alcoholconsumptie binnen deze doelgroep (6, 11, 23, 24). De bloedmonsters werden allen verzameld binnen de eerstelijns verloskunde terwijl het in andere studies tweede of derdelijns verloskundige zorg betrof. Een andere mogelijke verklaring is dat onze metingen plaatsvonden rondom de twaalfde week van de zwangerschap, in overige studies zijn ook eerdere momenten in de zwangerschap gemeten (6, 11, 23, 24). Het is mogelijk dat zwangere vrouwen zich in deze fase van de zwangerschap strikter aan de leefregels houden dan in een vroegere fase, als vrouwen nog niet weten dat ze zwanger zijn. Deze mogelijkheid kan verder worden onderzocht in een vervolgstudie, waarbij vrouwen met verschillende zwangerschapsduren worden geïncludeerd. Daarnaast zouden ook andere patiëntengroepen onderzocht kunnen worden voor een uitgebreidere klinische validatie.

In de afgelopen jaren zijn meerdere onderzoeken uitgevoerd naar biomarkers die nauwkeurig en betrouwbaar alcoholgebruik kunnen detecteren. Deze biomarkers spelen een belangrijke rol bij het diagnosticeren van alcohol gerelateerde aandoeningen en bij het monitoren van alcoholgebruik in klinische en forensische situaties. PEth is specifiek voor alcoholgebruik, heeft een hoge sensitiviteit en specificiteit (25) en is nauwelijks gevoelig voor interferenties. PEth kan worden gebruikt met een brede detectieperiode van uren tot enkele weken. Deze eigenschappen maken PEth een geschikte toevoeging naast de combinatie van EtG en CDT. Een nadeel in de toepassing van PEth in vergelijking met EtOH is dat met PEth geen goed onderscheid gemaakt kan worden tussen kortstondig en langdurig alcohol gebruik (12, 22), omdat het nog 2-3 weken na het laatste drinkmoment aantoonbaar is. EtOH en in mindere mate EtG hebben een kortere halfwaardetijd en zijn daardoor beter geschikt voor het detecteren van recent alcohol gebruik (9, 13, 20). Tot slot is de bepaling van PEth evenals CDT en EtG duurder dan dat van EtOH.

EtG is erg sensitief en kan via een urinemonster worden gemeten. Volgens de ‘Wie-doet-wat ‘database van de NVKC wordt EtG op dit moment door een beperkt aantal laboratoria in Nederland bepaald. In vergelijking met EtG heeft PEth een langere detectieperiode die afhankelijk is van de ingenomen hoeveelheid Ethanol waardoor het aantrekkelijker is voor het vaststellen van recent alcoholgebruik. Een combinatie van de analyse van EtG in urine en PEth in bloed kan worden toegepast om zowel recent alcoholgebruik (met EtG) als chronisch gebruik (via PEth) te detecteren (13).

Bij juridisch-medische toepassingen wordt in de literatuur aanbevolen om PEth of EtG in bloed te bepalen, omdat de mogelijkheid tot manipulaties door de persoon bij bloedafname veel beperkter zijn dan bij urine. In een Belgisch onderzoek waarbij personen werden beoordeeld op hun geschiktheid om auto te rijden, werden naast CDT ook PEth en EtG (in haar) geanalyseerd (14). De resultaten van de studie laten zien dat PEth of EtG positief waren bij 22 personen, terwijl deze een negatief resultaat voor CDT lieten zien. Dit suggereert dat PEth ook minder kans op het missen van alcoholgebruik biedt.

Samengevat zien wij een rol voor PEth als veelbelovende biomarker voor het opsporen van alcoholgebruik in verschillende situaties. Deze studie toont de succesvolle implementatie van de LC-MS/MS-analysemethode aan, die in de toekomst naast EtG en CDT, geïmplementeerd kan worden in andere goed geoutilleerde klinisch chemische laboratoria.

This study evaluates the performance of an LC-MS/MS method for measuring Phosphatidylethanol (PEth) in whole blood as a biomarker for alcohol consumption. PEth is a phospholipid specifically formed in the presence of ethanol and embedded in cell membranes. Compared to traditional biomarkers such as CDT and EtG, PEth demonstrates high sensitivity and specificity, making it a promising biomarker for various clinical applications. PEth provides the capability to detect both shortterm and chronic alcohol use. The described method demonstrated excellent analytical performance, stability, and low interference. In the investigated cohort of pregnant women (n=800), around the 12th week of pregnancy, a low prevalence of alcohol consumption is observed. This study illustrates the successful validation of the LC-MS/MS method, which, in our opinion, establishes the foundation for the routine application of PEth in other well-equipped clinical chemical laboratories in the Netherlands.